Riepilogo:

Questo articolo esamina due fattori chiave che devono essere considerati nelle strategie di purificazione delle proteine: requisiti di applicazione a valle e caratteristiche biologiche delle proteine ​​stesse. L'articolo sottolinea che la purificazione delle proteine ​​di alta qualità è la base per l'affidabilità e la ripetibilità dei dati sperimentali, in particolare per la produzione di proteine ​​ricombinanti. Diversi scenari di applicazione hanno requisiti specifici per la purezza delle proteine, l'attività o il contenuto di endotossina e le caratteristiche delle proteine ​​possono influire significativamente sulle strategie di purificazione. Secondo casi specifici, l'articolo illustra che le proteine ​​uniche dovrebbero adottare schemi di purificazione personalizzati. Infine, è stato proposto un processo sistematico di produzione di proteine ​​(Figura 1), sottolineando il controllo di qualità a pieno processo dalla selezione dei sistemi di espressione, la progettazione delle costruzioni all'ottimizzazione della purificazione e raccomandando la valutazione dell'omogeneità e della funzionalità delle proteine ​​attraverso tecniche biofisiche (come SEC-Mal, DSF, ecc.). Questo articolo mira a fornire una guida pratica per i ricercatori, aiutandoli a formulare strategie di purificazione efficienti e ripetibili in base alle caratteristiche e ai requisiti dell'applicazione delle proteine ​​target, migliorando così la qualità e l'efficienza della ricerca scientifica.

 

Figura 1. Diagramma schematico del processo di produzione delle proteine

 

Produzione di proteine ​​ad alta richiesta - Esempi di identificazione dei problemi, progettazione della strategia di mitigazione e produzione corrispondente

 

1. Legatura dell'acido nucleico con la proteina:

Quando si purificano le proteine ​​leganti l'acido nucleico, sono necessari più passaggi per rimuovere la contaminazione dell'acido nucleico. Durante la lisi, devono essere aggiunte nucleasi (come la nuclease SM (benzonase®) o DNase o RNase), ma gli acidi nucleici legati non possono essere completamente rimossi. Sostituire le fasi di rimozione dell'acido nucleico, come la precipitazione PEI o streptomicina solfato, purificazione dell'eparina o cromatografia a scambio ionico. La presenza di acidi nucleici è stata monitorata dal rapporto di A26 0 nm\/A28 0 nm durante il processo di purificazione. Se il rapporto era inferiore a 0,6, indicava che la purezza proteica era relativamente alta e la contaminazione da acido nucleico era minima. Per le proteine ​​con acidi nucleici fortemente legati, possono essere temporaneamente denaturati (come trattati con urea) e quindi rinaturati. Punti chiave: utilizzare reagenti di alta qualità, tamponi freschi e colonne pulite (pulito con NaOH da 0,5 m prima dell'uso).

 

2. Ferritina di mouse Ferritina pesante catena:

Lo scopo di produrre la proteina a catena pesante della ferritina di topo purificata (MFTH1) è la microscopia crioelettronica a particella singola ad alta risoluzione (Cryo-EM). Il vettore di espressione di Escherichia coli codificava MFTH1 senza etichetta è stato interrotto ultrasonicamente senza aggiungere nucleasi. Dopo il riscaldamento a 7 0 gradi, è stato sottoposto a precipitazioni di solfato di ammonio, dialisi e fasi di cromatografia di esclusione delle dimensioni. Il campione risultante ha mostrato la presenza di una grande quantità di contaminanti nelle immagini di microscopia a cryelectron (Figura 2A), che non era completamente inadatta alla sua applicazione. Ottimizzare i passaggi. Aggiungi la nucleasi SM durante il processo di lisi cellulare e il processo di dialisi dopo la precipitazione del solfato di ammonio, quindi aggiungi la fase di cromatografia di scambio anionico per ridurre il rapporto tra A26 0 nm\/A280NM da 1,4 a 0,8. Dopo la cromatografia di esclusione delle dimensioni, il rapporto tra A260NM\/A280NM del campione MFTH1 finale era 0,56. Le immagini di microscopia SDS-PAGE e crioelettronica (Figura 2B) hanno mostrato che la proteina era molto pura, indicando che i contaminanti erano stati effettivamente rimossi.

Figura 2 catena pesante della ferritina di topo

 

 

 

3. proteina chimerica umana dsrbec (dsrbd-egf-chimera):

Il DSRBEC è formato dalla fusione del dominio di legame dell'RNA a doppio filamento (DSRBD) della proteina chinasi R e del fattore di crescita epidermico umano (HEGF). Quando il DSRBD è espresso in Escherichia coli, mostra un'abilità di legame dsRNA estremamente elevata. Dopo la lisi cellulare, l'RNA contamente ostacolerà il legame delle proteine ​​ricombinanti alla colonna di cromatografia di affinità a ioni metalliche fisse (IMAC). I metodi convenzionali come la precipitazione PEI o streptomicina solfato, il trattamento con RNasi o le soluzioni tampone ad alto contenuto di sale non possono rimuovere l'RNA. La lisi cellulare è stata eseguita utilizzando un tampone contenente urea 4M. Il surnatante è stato caricato su una colonna iMac e l'urea M da 4m a 0 è stata lentamente usata durante la notte (Renaturazione della colonna). Il tampone di rinnovamento è stato aggiunto con imidazolo ed eluito dalla colonna iMac. Il perfezionamento finale è stato effettuato attraverso la filtrazione su gel Superdex 75 per ottenere DSRBEC funzionalmente attivo.

 

4. Proteine ​​legate a cationi bivalenti o altri cofattori:

Per le proteine ​​che interagiscono con cationi bivalenti come Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ o altri cofattori, è fondamentale aggiungere specifici cationi (o altri cofattori) durante l'espressione. Durante il processo di purificazione è inoltre richiesta una piccola quantità degli stessi cationi divalenti (o altri cofattori). Tuttavia, l'uso di eventuali agenti chelanti (come EDTA, EGTA) e agenti chelanti che riducono (come DTT o DTE) devono essere evitati. Quando si tratta di proteine ​​legate a cationi bivalenti, è necessario utilizzare una miscela di inibitori della proteasi senza agenti chelanti per confermare la presenza effettiva di cationi divalenti (o altri cofattori) nella proteina purificata attraverso metodi spettroscopici (come la spettrofotometria di assorbimento atomico).

 

5. Ferridossina ricombinante (RFD) contenente un singolo cluster [2Fe ± 2s] da cianobatteri termofili masco -masco

La ferridoxina è una proteina solubile in ferro-zolfo che partecipa alle reazioni di trasferimento di elettroni. La ferroredossina di tipo vegetale trasporta un singolo cluster [2Fe ± 2s] come un accettore di elettroni del fotosistema I. La deformazione di Escherichia coli BL21 (DE3) ha espresso la proteina RFD ricombinante nel mezzo TB contenente Fecl3 e antibiotici da 10 mm. L'eluizione della colonna di cattura iMac è stata eseguita utilizzando un tampone contenente istidina da 10 mm per evitare l'imidazolo e prevenire la distruzione del cluster [2Fe ± 2s]. Lo scambio di anioni e la cromatografia di esclusione delle dimensioni sono stati utilizzati per ulteriore purificazione e concentrazione a 12 mg\/mL per lo screening di cristallizzazione. Rispetto alla produzione ricombinante di ferroredexina, la ferroredixina naturale purificata dalle alghe blu-verde masticocladus laminosus ha raggiunto una maggiore risoluzione durante la cristallizzazione.

 

6. Proteine ​​usate come antigeni

Le proteine ​​sono spesso usate come antigeni per recuperare i ligandi specifici del bersaglio. La prima cosa da considerare è se la proteina viene utilizzata per l'immunità in vivo per ottenere IgG monoclonali o policlonali convenzionali o per programmi che coinvolgono IgG di cammello o processi di selezione in vitro.

 

6.1 Antigeni utilizzati per la produzione di anticorpi di routine

Quando gli antigeni vengono utilizzati per produrre anticorpi IgG monoclonali, di solito non è necessario il corretto ripiegamento dell'antigene, poiché la maggior parte degli anticorpi monoclonali riconoscono epitopi lineari che non sono fortemente influenzati dalla struttura dell'antigene e persino antigeni denaturati (come le proteine ​​del corpo di inclusione) rimangono efficaci. Tuttavia, la purezza deve essere strettamente controllata per evitare forti contaminanti immunogeni che interferiscono con la risposta immunitaria e causando il dominio degli anticorpi non bersaglio.

 

6.2 Screening della libreria coniugata

Particolare attenzione dovrebbe essere prestata al mantenimento della naturale conformazione dell'antigene durante l'elaborazione della libreria nanobodinica ottenuta mediante immunizzazione del cammello. A differenza degli anticorpi convenzionali, gli anticorpi di cammello (in particolare i nanobodie) tendono a riconoscere gli epitopi strutturali, che è correlato alla loro unica struttura del sito complementare convessa. Allo stesso modo, durante lo screening di grandi librerie di anticorpi sintetici o naturali in vitro, l'antigene deve mantenere una struttura completamente coerente con l'applicazione target. Poiché il processo di screening stesso non è distorto, se l'antigene ha eterogeneità errata, aggregazione o eterogeneità conformazionale, un gran numero di coniugati che si prendono di mira epitopi non naturali possono essere scretizzati.

 

 

 

7. Proteine ​​contenenti legami disolfuro intermolecolari o intramolecolari o cisteina libera

I legami disolfuro sono cruciali per stabilizzare la struttura naturale delle proteine. Durante il processo di purificazione, quando si purificano le proteine ​​contenenti legami disolfuro intermolecolari o intramolecolari, è necessario evitare di aggiungere agenti riducenti per prevenire cambiamenti conformazionali delle proteine, alterando così le loro funzioni. Per le proteine ​​contenenti cisteina libera, gli agenti di riduzione sono indispensabili in tutte le fasi del processo di purificazione, in particolare durante lo stoccaggio, per prevenire la formazione di legami disolfuro artificiali. Gli agenti riducenti più comunemente usati sono il ditiotreitol (DTT), -MerCaptoetanolo (-me) e Tris (2- carbossietil) fosfina cloridrato (TCEP). Per le resine IMAC incompatibili con DTT o TCEP, si consiglia di utilizzare -me e sostituirle con altri agenti riducenti nei passaggi successivi.

 

8. Frammento di anticorpi ricombinanti

Sebbene la struttura dei frammenti di anticorpi ricombinanti (come i nanobodie) sia più semplice di quella delle IgG, la loro funzione dipende dalla corretta formazione di legami disolfuro. Nei sistemi di espressione batterica, anche con l'adozione di strategie di ottimizzazione, possono ancora verificarsi prodotti mal ripiegati o parzialmente piegati, che esistono sia nella parte solubile che nel corpo di inclusione. Più nascosto è che anche frammenti di anticorpi piegati correttamente possono formare aggregati solubili (aggregazione colloide) attraverso placche idrofobiche sulla superficie. Tali aggregati sono difficili da identificare nei test funzionali di routine (come ELISA) perché il legame multivalente può mascherare il declino dell'affinità monomerica, ma la loro presenza può influenzare seriamente le applicazioni che si basano sulla dimensione delle piccole molecole (come la microscopia a super-risoluzione). Pertanto, fare affidamento esclusivamente su SDS-PAGE è insufficiente per valutare la qualità del campione. I metodi biofisici come la filtrazione in gel (Figura 3) devono essere adottati per distinguere i monomeri (picchi principali) dai aggregati (picchi di volume di esclusione). I punti di controllo chiave includono: ottimizzazione dell'ambiente redox durante l'espressione per promuovere la formazione di legami disolfuro e ottimizzare le condizioni di archiviazione dopo la purificazione per prevenire l'aggregazione. Queste misure sono cruciali per garantire la monodispersità e la funzione dei frammenti di anticorpi.

Figura 3. Separazione di filtrazione in gel di aggregati solubili di nanobodie

 

9. Frammenti solubili del recettore dei linfociti LLT1

L'espressione ricombinante delle proteine ​​disolfuro dipendenti dal legame (come il recettore dei linfociti LLT1) spesso affronta difficoltà di piegatura. La filtrazione in gel di LLT1 di tipo selvaggio ha mostrato picchi di aggregazione e picchi di dimero (Figura 4A), ma la spettrometria di massa ha rivelato erroneamente la piegatura causata da cisteina non accoppiata nel dimero (Figura 4B). A tale scopo, sono stati progettati due mutanti: uno ha rimosso il problema della cisteina, con conseguente improvviso calo della resa (Figura 4A); Dopo l'introduzione della neocisteina per ricostruire il legame disolfuro conforme, il mutante non solo aveva una resa elevata e una buona stabilità, ma poteva anche cristallizzazione (Figura 4C) e la struttura 3D confermava che il mutante formava il legame disolfuro corretto e mantenne la piegatura naturale. Questo caso dimostra che progettando razionalmente legami disolfuro conformi, combinati con filtrazione in gel e analisi di spettrometria di massa, è possibile risolvere il problema di piegatura delle proteine ​​ricombinanti e è possibile risolvere proteine ​​funzionali con strutture stabili e rendimenti elevati.

Figura 4. La ricostruzione del legame disolfuro migliora la piegatura e la resa di LLT1 solubile

 

 

 

10. Proteine ​​facilmente aggregabili

La purificazione delle proteine ​​ricombinanti spesso affronta il problema dell'aggregazione e la sua formazione segue il meccanismo di "crescita della nucleazione": una piccola quantità di aggregati solubili si forma prima e quindi innesca aggregazione insolubile su larga scala. To address this challenge, multi-level strategies need to be adopted: At the expression stage, this can be achieved by optimizing the strain, reducing the culture temperature, using modified culture media or different solubilizing fusion proteins, and replacing expression systems (insect\/mammalian cells), etc. During the purification stage, rapid operation (in a 4 degree C environment) is required to avoid excessive protein concentration, and a "rapid purification strategy" (such as direct connection of IMAC a Sec) dovrebbe essere adottato per rimuovere prontamente i nuclei aggregati. In generale, quando devono essere presi in considerazione soluzioni tampone di screening, fattori come la composizione dei componenti, il valore del pH, l'agente dissociatore o il solubilizzatore (Figura 5). Attraverso un'ottimizzazione fine del rilevamento ortogonale (come SEC, CD, LS, DSF e spostamento della temperatura in base al calore della fluorescenza, ecc.), Sono state determinate la qualità delle proteine ​​e la soluzione tampone più adatta.

Figura 5. Strategie per alleviare l'aggregazione proteica

 

11. Cristallizzazione della chinasi clk1 umana (come ottenere lotti riproducibili)

Per ottenere chinasi CLK1 non fosforilata omogenea per studi di cristallizzazione, è stato adottato uno schema di collaborazione multi-strategia. In primo luogo, è stato co -espresso con λ -fosfatasi in Escherichia coli per eliminare l'eterogeneità dell'autofosforilazione. Sebbene la resa sia stata ridotta, è stata garantita la defosforilazione completa. Dopo la cattura da IMAC, l'eluente è stato integrato con stabilizzatori (arginina da 50 mm, acido glutammico da 50 mm e DTT da 10 mm) per prevenire l'aggregazione, concentrato e il suo tag è stato rimosso dalla digestione TEV. Quindi, l'oligomero corretto è stato separato da SEC (contenente 5% di glicerolo e -me). La fase di scambio anionico cruciale finale distingue tra gruppi CLK1 cristallini (non fosforilati) e non cristallini (parzialmente fosforilati). Vale particolarmente la pena notare che la modalità di lisi cellulare influisce significativamente sulla stabilità delle proteine: il metodo ad alta pressione e ad alta temperatura porta ad aggregazione irreversibile di CLK1, evidenziando l'importanza di un lieve trattamento per la preparazione della chinasi.

 

 

 

12. produrre galectina -1 con capacità di legame ligando stabile

Per preparare la galectina funzionale -1 per gli studi di legame del ligando, le strategie di espressione e purificazione di quattro costrutti (galectina di tipo selvaggio senza etichetta e senza etichetta -1, sono state confrontate la galectina mutante senza cisteine ​​{}}) senza etichetta. I risultati chiave indicano che la purificazione della cromatografia di affinità del lattosio può essere efficacemente schermata per le proteine ​​piegate correttamente, ma deve essere combinata con una dialisi accurata (tampone HEPES) per rimuovere completamente il lattosio dal sito di legame e ripristinare l'attività CRD. La galectina di tipo selvaggio -1 è soggetta a ossidazione e inattivazione e la sua stabilità rimane limitata anche in presenza di agenti riducenti (Figura 6). Tuttavia, il mutante privo di cisteina migliora significativamente la stabilità a lungo termine mantenendo un'attività di agglutinazione comparabile e la stabilità termica (verificata da nanodsf, ITC, ecc.) Eliminando la dipendenza dal legame disolfuro.

Figura 6. La caratterizzazione idrodinamica della galectina ricombinante -1 rivela la sua instabilità

 

13. Rimozione endotossina

Il metodo di rimozione dell'endotossina si basa sulla cromatografia di affinità tra cui la cromatografia caricata positivamente (scambio di anioni), l'uso di ligandi polycaticici (come poli-L-lysine (PLL), poliammina immobilizzata (polimixina B)) e l'aggiunta del Triton X {{}}. Durante il processo di purificazione, presta attenzione alla preparazione della soluzione tampone con acqua senza LPS e utilizza nuove colonne o colonne che sono state utilizzate solo in altre purificazioni senza LPS. Per la contaminazione endotossina, la pompa cromatografica\/sistema fluido può essere incubata durante la notte in 0. 5m NaOH o per 4 ore in 1. 0 M NaOH. La quantità finale di LPS nel campione è stata valutata utilizzando il reagente lisato di amebociti limulus (LAL) e è stato verificato se fosse al di sotto del limite richiesto per l'applicazione specifica.

 

14. Complesso proteico

L'espressione e la purificazione dei complessi proteici devono essere ottimizzati in base a condizioni specifiche. Le sfide includono l'instabilità o la mal di ripiegamento delle subunità. Ogni subunità può essere espressa in modo indipendente e assemblato in vitro o co-espresso per formare complessi proteici funzionali. Il design delle costruzioni deve essere attentamente introdotto con etichette di purificazione o rilevamento per evitare di interferire con l'assemblaggio, specialmente quando le informazioni complesse sono limitate e sono necessarie ottimizzazioni multiple. Durante il processo di purificazione, l'integrità e la stabilità del complesso devono essere valutate. I metodi includono SDS-PAGE (rilevamento delle subunità), SEC (omogeneità), sec-mali (analisi della massa molare), fotometria di massa o spettrometria di massa naturale (verifica di massa). Va notato che il complesso può dissociarsi a basse concentrazioni. In questo momento, il metodo o il tampone cromatografico (ad esempio attraverso le condizioni di screening della deriva termica o del DSF) deve essere ottimizzato. Inoltre, ridurre le fasi di purificazione può impedire la perdita di subunità di interazione debole ed bilanciare l'efficienza di purificazione e l'integrità del complesso.

 

 

 

15. Purificazione dei complessi antigene-anticorpi

I complessi anticorpi-antigene sono esempi tipici di complessi proteici. La loro co-cristallizzazione può rivelare modelli di legame e guidare l'ottimizzazione dell'ingegneria degli anticorpi. I metodi tradizionali richiedono purificazione separata di antigeni e anticorpi e quindi mescolarli. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che le strategie di co-espressione e co-purificazione sono più efficienti. È necessaria solo una singola purificazione per ottenere il complesso e allo stesso tempo, gli antigeni instabili possono essere stabilizzati attraverso anticorpi e persino un'espressione priva di etichetta. In questa situazione specifica, la filtrazione SDS-PAGE e GEL (SEC) sono generalmente sufficienti per valutare la purezza e la qualità del complesso.

 

Riepilogo

La purificazione delle proteine ​​è una tecnologia fondamentale nella ricerca scientifica. La produzione di proteine ​​su scala accademica di solito segue le strategie standard e può produrre proteine ​​solubili di alta purezza a livello di milligrammo, che sono ampiamente utilizzate in biologia strutturale, biochimica e ricerca funzionale. Tuttavia, i requisiti speciali delle applicazioni a valle (come la necessità di nessuna endotossina negli esperimenti su animali e nessuna contaminazione da nucleasi nella ricerca sull'acido nucleico) o le caratteristiche intrinseche delle proteine ​​(come una facile aggregazione, contenente legami disolfuri o alta affinità nucleica) spesso richiedono soluzioni personalizzate. Questa recensione, in risposta a queste circostanze speciali, propone strategie raffinate che vanno dalla selezione dei sistemi di espressione, dalla progettazione di costrutti (ottimizzazione di etichette e confini del dominio) al processo di purificazione e introduce il controllo di qualità (come SEC, SDS-PAGE, ATTENZIONE, ecc.) Ai passi chiave. Alcune applicazioni richiedono anche ulteriori analisi (come il rilevamento dell'endotossina e la determinazione dei residui di acido nucleico), simile al concetto di "garanzia della qualità" (QA) nell'industria biofarmaceutica, ovvero per prevenire difetti attraverso processi sistematici. Formulando linee guida di controllo di qualità e chiarindo standard specifici per i reagenti proteici utilizzati nella ricerca scientifica, l'obiettivo è stabilire norme di purificazione proteica più rigorose per i laboratori accademici, migliorare l'affidabilità e la ripetibilità dei dati sperimentali e colmare il divario tra la ricerca di base e gli standard industriali.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5