Principi di base e flusso di lavoro della sintesi-peptidica in fase solida (SPPS)
Sintesi peptidica in fase-solida (SPPS)è un metodo per sintetizzare peptidi su un supporto solido. Le principali strategie SPPS includono ilMetodo Boce ilMetodo FMOC. La sintesi peptidica è un processo ripetitivo di aggiunta sequenziale di amminoacidi ed è generalmente effettuata dalC-terminale (estremità carbossilica)alN-terminale (estremità amminica). Innanzitutto, il gruppo carbossilico del primo amminoacido del peptide bersaglio è attaccato covalentemente ad un supporto solido (resina). Utilizzando il gruppo amminico di questo amminoacido come punto di partenza, il gruppo protettivo N-terminale viene rimosso e la catena peptidica in crescita viene allungata mediante reazione con un eccesso di un secondo amminoacido attivato. Questo ciclo-accoppiamento → lavaggio → deprotezione → neutralizzazione e lavaggio → accoppiamento successivo-viene ripetuto finché non viene raggiunta la lunghezza del peptide desiderata. Infine, la catena peptidica viene scissa dalla resina e purificata per ottenere il peptide bersaglio. Quando il -gruppo amminico è protetto conBoc (terz-butilossicarbonile), il metodo è denominatoSintesi peptidica in fase solida-basata su Boc-. Quando il -gruppo amminico è protetto conFmoc (9-fluorenilmetilossicarbonile), è noto comeSintesi peptidica in fase solida-basata su Fmoc-.
Sintesi peptidica in fase solida-basata su Boc-(metodo Boc)
NelMetodo Boc, Gruppi Boc rimovibili mediante acido trifluoroacetico (TFA)vengono utilizzati per proteggere i -gruppi amminici, mentregruppi protettivi di tipo benzilico-vengono impiegati per le catene laterali. Durante la sintesi, un amminoacido -protetto Boc- viene prima legato covalentemente alla resina. Il gruppo Boc viene quindi rimosso con TFA e l'ammino terminale libero risultante viene neutralizzato con trietilammina. L'amminoacido successivo viene attivato utilizzandoDCC (dicicloesilcarbodiimmide)e accoppiato per estendere la catena peptidica. Dopo il completamento dell'assemblaggio, il peptide bersaglio viene separato dalla resina utilizzando, tipicamente, un acido fortefluoruro di idrogeno anidro (HF)Oacido trifluorometansolfonico (TFMSA).Nel metodo di sintesi Boc, sono necessari ripetuti trattamenti acidi per rimuovere i gruppi protettivi prima di ogni fase di accoppiamento. Ciò può portare a diverse reazioni collaterali, come la scissione prematura del peptide dalla resina e l'instabilità delle catene laterali degli amminoacidi in condizioni acide, con conseguenti reazioni collaterali indesiderate.
Sintesi di peptidi in fase solida-basata su Fmoc-(metodo Fmoc)
In1978, Meienhofer e Athertonsviluppato una strategia di sintesi peptidica utilizzandoFmoc (9-fluorenilmetilossicarbonile)come il -gruppo protettivo degli aminoacidi, noto comeMetodo FMOC. In questo approccio, il -gruppo amminico è protetto conbase-labile Fmoc, mentre le catene laterali sono protette congruppi protettivi di tipo acido-labile Boc-.Uno dei principali vantaggi del Fmoc come gruppo amminico-protettivo è il suostabilità in condizioni acide; non viene influenzato dal trattamento con reagenti comeacido trifluoroacetico (TFA)e può essere rimosso selettivamente utilizzandofondo delicato. Allo stesso tempo, i gruppi protettivi della catena laterale-come Boc sono stabili in condizioni basiche e vengono rimossi mediante trattamento acido. Infine, il peptide viene scisso quantitativamente dalla resina utilizzandoTFA/diclorometano (DCM), evitando l'uso di acidi forti e migliorando così la sicurezza e la compatibilità con la sintesi peptidica di routine.
Storia dello sviluppo della sintesi di peptidi in fase solida (SPPS)
1. Fase fondativa (dall'inizio del XX secolo al 1963)
In1902, Emil Fisherè stato il primo a esplorare la sintesi dei peptidi, ma i progressi sono stati lenti a causa di limitazioni tecniche. Prime sintesi impiegategruppi protettivi benzoile e acetile, che erano difficili da rimuovere e spesso portavano ascissione della catena peptidica.
In1932, Max Bergmane i colleghi-lavoratori hanno presentato ilgruppo benzilossicarbonile (Z).come un -gruppo protettivo degli aminoacidi. Questo gruppo potrebbe essere rimosso inidrogenazione catalitica o condizioni acide, fornendo uno strumento più affidabile per la sintesi peptidica e gettando le basi per lo sviluppo della sintesi peptidica in fase solida- negli anni '60.
Durante il1950s, gli scienziati hanno sintetizzato con successo una varietà dipeptidi biologicamente attivi, ad esempioossitocina e insulina. Questi risultati hanno fatto avanzare ulteriormente la chimica dei peptidi e hanno gettato le basi per l'emergere della sintesi peptidica in fase-solida.
2. Fase pionieristica (1963)
In1963, Robert B. Merrifieldha proposto ilmetodo di sintesi peptidica in fase solida- (SPPS)., in cui ilAmminoacido C-terminaleè ancorato ad un supporto resinoso, e la catena peptidica viene allungata attraverso cicli ripetuti dideprotezione e accoppiamento. Questo approccio ha notevolmente semplificato il processo di sintesi del peptide ed è diventato ilmetodo preferitoper l'assemblaggio del peptide.
Merrifield usatoBoc (terz-butilossicarbonile)per proteggere il -gruppo amminico. Verso la fine degli anni '60 sviluppò anche ilprimo sintetizzatore di peptidi completamente automatizzatoe sintetizzato con successoproteine biologichead esempioribonucleasi (124 aminoacidi). Per questi risultati rivoluzionari, Merrifield è stata insignita del premioPremio Nobel per la Chimica nel 1984.
3.Fase di innovazione tecnologica (1972)
In1972, Lou Carpinosviluppato ilGruppo protettivo 9-fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc)., il che può essererimosso delicatamente in condizioni basiche, riducendo le reazioni collaterali. Ciò lo ha reso particolarmente adatto apeptidi complessiEsintesi automatizzata.
ILMetodo FMOCha gradualmente sostituito il metodo Boc come strategia principale. Sintetizzatori automatizzati di peptidi basati su entrambiChimica Fmoc e Bocsono stati successivamente sviluppati, guidando ilautomazione della sintesi peptidicae migliorando notevolmente l’efficienza e la riproducibilità.
4. Maturità e fase di espansione (dagli anni '90 ad oggi)
Ottimizzazione della resina e dei reagenti:Sviluppo diresine modificate con PEG-idrofile e ad alto carico-modificateed efficienti reagenti di accoppiamento comeHBTUEHATUha migliorato significativamente l'efficienza e la resa della sintesi peptidica in fase-solida (SPPS).
Integrazione tecnologica:Nuovi approcci comesintesi assistita da microonde-Echimica del flussohanno ridotto i tempi di reazione e aumentato ulteriormente le rese.
Principi di base e flusso di lavoro di SPPS:
Il principio fondamentale della sintesi peptidica in fase solida- è ilcostruzione graduale di una catena peptidica su un supporto solido, utilizzandoproteggere le strategie del gruppoEReazioni di condensazione (accoppiamento).raggiungereassemblaggio peptidico efficiente e controllabile.
1. Ruolo del supporto solido (resina) nella sintesi peptidica di fase solida (SPPS)
A resina polimerica insolubile-comeresina polistirene-divinilbenzene reticolata-resina Wang o resina ammidica Rink-è selezionato come solido supporto in SPPS. La superficie in resina contienegruppi funzionali(ad esempio, gruppi idrossilici o amminici) che possono formarsilegami covalenti con un'estremità della catena peptidica, solitamente ilCapolinea C-, ancorando il peptide al supporto solido. Questo attacco covalente assicura che il peptide crescarimane legato alla resina durante tutta la sintesi, il che notevolmentefacilita le successive fasi di reazione, lavaggio e purificazione
2. Strategia di gruppo di protezione nella sintesi di peptidi in fase solida (SPPS)
Durante la sintesi del peptide, il-gruppo amminico, gruppo carbossilico e gruppi funzionali della catena laterale-reattivadi amminoacidi (come tiolo, carbossile e gruppi amminici) sono inclini areazioni collaterali. Per prevenire queste reazioni indesiderate,gruppi protettivivengono utilizzati. I gruppi protettivi comuni includono:-Gruppi di protezione degli aminoacidi:
Boc (terz-butilossicarbonile):Acido-labile, facilmente rimovibile sottocondizioni acide.
Fmoc (9-fluorenilmetilossicarbonile):Stabile in condizioni acide, può essere rimosso sottocondizioni di base(ad esempio, soluzione piperidina/DMF).Gruppi di protezione-della catena laterale:Selezionato in base alle proprietà chimiche della catena laterale dell'amminoacido. I gruppi comuni includonobenzile (Bn), tert-butile (tBu), tritile (Trt), ecc. Questi gruppi sonorimosso alla fine della sintesi, solitamente durante la scissione del peptide dalla resina, utilizzandoacido o altre condizioni specifiche.
3. Sintesi da C-Terminus a N-Terminus in SPPS
Insintesi peptidica in fase-solida (SPPS), l'assemblaggio del peptide solitamente inizia nelC-terminale (estremità carbossilica)e procede passo passo verso ilN-terminale (estremità amminica). Questo perché ilL'amminoacido C-terminale viene prima attaccato al supporto solido, e i successivi amminoacidi sono accoppiati agruppo amminico libero della catena peptidica già legato alla resina, allungando gradualmente la catena peptidica.
4. Reazione di accoppiamento nella sintesi peptidica di fase solida (SPPS)
Gli aminoacidi protetti devono esserloattivatoin modo che il loroi gruppi carbossilici diventano reattivi, permettendo loro di formare alegame peptidicocon il gruppo amminico del peptide legato alla resina-. Comunereagenti attivantiincluderecarbodiimmidi(ad esempio, DCC, DIC),HOBt, HATU, EPyBOP. Una volta attivato, il gruppo carbossilico reagisce con il gruppo amminico libero in areazione di condensazione, formando unlegame ammidicoe quindi legando il nuovo amminoacido alla catena peptidica in crescita.
5. Operazioni ripetitive (cicliche) nella sintesi di peptidi in fase solida (SPPS)
Il processo prevederipetendo il ciclo di deprotezione → accoppiamento → lavaggio, aggiungendoun amminoacido per cicloallungare gradualmente la catena peptidica. Dopo ciascunoreazione di accoppiamento, la resina èlavato(ad esempio, con solventi come DMF o DCM) per rimuovere i reagenti non reagiti, i sottoprodotti-e gli amminoacidi in eccesso. ILIl -gruppo amminico del residuo appena aggiunto viene quindi deprotetto, esponendo un'ammina libera per prepararsi alla successiva reazione di accoppiamento. Questo ciclo viene ripetuto finché la sequenza peptidica desiderata non è completamente assemblata.
6. Scissione nella sintesi peptidica di fase solida- (SPPS)
Una volta che la catena peptidica ha raggiunto la lunghezza desiderata, lo èstaccato dal solido supportoutilizzando un reagente appropriato, mentre contemporaneamenterimuovendo tutti i gruppi protettivi. Un reagente di scissione comunemente usato èacido trifluoroacetico (TFA), che non solorompe il legame tra il peptide e la resinama ancherimuove i gruppi protettoricome Fmoc e Boc, ripristinando il peptide al suo statostato nativo. Una volta che la catena peptidica ha raggiunto la lunghezza desiderata, lo èstaccato dal solido supportoutilizzando un reagente appropriato, mentre contemporaneamenterimuovendo tutti i gruppi protettivi. Un reagente di scissione comunemente usato èacido trifluoroacetico (TFA), che non solorompe il legame tra il peptide e la resinama ancherimuove i gruppi protettoricome Fmoc e Boc, ripristinando il peptide al suo statostato nativo.
Attraverso questi passaggi,sintesi peptidica in fase-solida (SPPS)abilita ilassemblaggio efficiente e controllato di catene peptidiche su un supporto solido, evitando i complicati passaggi intermedi di purificazione richiesti nella tradizionale sintesi in soluzione-fase e in modo significativomigliorare l’efficienza e la resa della sintesi.
Attraverso questi passaggi,sintesi peptidica in fase-solida (SPPS)abilita ilassemblaggio efficiente e controllato di catene peptidiche su un supporto solido, evitando i complicati passaggi intermedi di purificazione richiesti nella tradizionale sintesi in soluzione-fase e in modo significativomigliorare l’efficienza e la resa della sintesi.
