Qual è l'impatto della concentrazione del flusso di alimentazione sulle cassette di ultrafiltrazione?

Quando ho iniziato a lavorare con le cassette di ultrafiltrazione (UF), agli inizi come fornitore di filtri, devo ammettere che non ho prestato molta attenzione alla concentrazione del mangime oltre a controllare se la soluzione che stavo elaborando fosse "abbastanza densa". La situazione è cambiata rapidamente: quando un cliente biotecnologico si è scontrato con un muro con la fase di concentrazione degli anticorpi, accusando frequenti intasamenti e velocità di flusso stranamente incoerenti. Si è scoperto che stavano spingendo molto più di quanto la loro cassetta UF potesse gestire, e questo è costato loro giorni di inattività e un lotto di prodotti costosi. Se lavori con cassette UF, questo non è solo un piccolo dettaglio: è una delle leve più importanti che determinano il successo o il fallimento del tuo processo, dalla resa al tempo di esecuzione. Analizziamo in che modo la concentrazione del mangime influisce su ogni parte dell'UF e cosa ho imparato nel corso degli anni per far sì che le cose funzionino senza intoppi.

Per prima cosa, basiamolo su ciò che effettivamente fanno le cassette UF, solo per assicurarci di essere sulla stessa lunghezza d'onda. Se sei nuovo al gioco, una cassetta UF è un'unità autonoma con membrane piatte (consulta il nostroCassetta per fogli pianipagina per la suddivisione completa) che separa le molecole in base alla dimensione: le cose piccole passano attraverso la membrana, mentre quelle più grandi vengono "trattenute" e concentrate sul lato di alimentazione. Cosa li rende così popolari nel settore biofarmaceutico, alimentare e delle bevande e nelle acque reflue? Sono compatti, riutilizzabili (a volte, se puliti correttamente) e molto più coerenti rispetto alle vecchie membrane tagliate a mano. ILUltrafiltrazione a cassetteLa linea che offriamo è progettata per cicli scalabili, da piccoli lotti di laboratorio alla produzione completa, ed è per questo che abbiamo lavorato con clienti che vanno dalle startup biotecnologiche ai marchi alimentari globali.

La concentrazione dell'alimentazione, per coloro che non hanno approfondito la terminologia, è fondamentalmente la quantità di soluto target (o indesiderato) nella soluzione che stai pompando nella cassetta. Ad esempio, se stai concentrando anticorpi monoclonali (mAb) da un brodo di coltura cellulare, la concentrazione di alimentazione qui indica quanti grammi di mAb ci sono per litro di quel brodo. Non si tratta solo dell'obiettivo: ci sono anche impurità come detriti cellulari, componenti multimediali e sali tampone rimanenti mescolati. Il punto ottimale per la concentrazione del mangime è diverso a seconda del limite del peso molecolare della membrana (MWCO), giusto? Una cassetta UF da 30 KD funziona perfettamente per le piccole proteine, mentre una da 500 KD è per molecole più grandi come i vettori virali. Ho visto clienti afferrare la prima cassetta che guardavano, indipendentemente dalla concentrazione del mangime, ed è lì che iniziano gli errori.

Cominciamo con l'impatto più immediato: il tasso di flusso. Il flusso è il volume di soluzione che passa attraverso la membrana per unità di area all'ora: è la spina dorsale della produttività dell'UF. Quando la concentrazione del mangime è troppo elevata, il flusso diminuisce rapidamente e non in modo lineare. Ecco perché: durante l'elaborazione della soluzione, i soluti trattenuti si accumulano vicino alla superficie della membrana, formando quello che viene chiamato "strato di polarizzazione della concentrazione". Questo strato agisce come una barriera aggiuntiva, quindi l’acqua e i piccoli soluti devono lavorare di più per passare. Se la concentrazione del mangime è molto alta all'inizio, lo strato di polarizzazione diventa spesso spesso e presto difficilmente riuscirai a far passare il permeato. L'anno scorso avevo un cliente che utilizzava una cassetta di ultrafiltrazione da 30 KD su un surnatante di coltura cellulare densa: si nutrivano con 25 g/L di proteine, quando la nostra raccomandazione era 10-15 g/L. Il loro flusso è sceso da 60 L/m²/ora a 12 L/m²/ora in 2 ore e hanno dovuto spegnersi per pulire prematuramente la cassetta, sprecando 12 ore di funzionamento. Ancora peggio, la polarizzazione ad alta concentrazione ha portato alcune proteine ​​a rimanere intrappolate in quello strato, quindi la loro resa è stata inferiore del 18% rispetto a quanto previsto.

Ma non si tratta solo del flusso: la concentrazione dell'alimentazione è anche direttamente collegata all'incrostazione della membrana, che è il grande spauracchio dell'UF. Le incrostazioni si verificano quando soluti, detriti o aggregati si attaccano permanentemente alla superficie della membrana o alle pareti dei pori, ed è molto peggio con mangimi eccessivamente concentrati. Quando i soluti sono stipati insieme nel mangime, è più probabile che entrino in collisione con la membrana e rimangano intrappolati. Nel corso degli anni ho pulito centinaia di cassette UF e, nell'80% dei casi, le incrostazioni pesanti sono riconducibili a una concentrazione di mangime pari a 2-3 volte l'intervallo raccomandato. Ad esempio, un cliente del settore alimentare che lavora succhi di frutta desiderava concentrarsi a 30° Brix in un unico passaggio, invece di 15° Brix (che è il punto ideale per la sua cassetta da 10 KD). La pectina e lo zucchero del succo hanno iniziato ad accumularsi sulla membrana entro 30 minuti e, alla fine del ciclo, i pori della membrana erano parzialmente ostruiti, quindi hanno ottenuto solo un quarto della concentrazione prevista e hanno dovuto sostituire la cassetta dopo tre cicli invece di 10. Ciò si traduceva in costi per litro molto più alti rispetto a quelli che avrebbero ottenuto se avessero diviso la concentrazione in due passaggi con una concentrazione di alimentazione inferiore ogni volta.

La resa è un’altra area in cui la concentrazione del mangime colpisce duramente, soprattutto nel settore biofarmaceutico dove ogni grammo di prodotto è importante. Quando il tuo mangime è troppo concentrato, non solo ottieni più incrostazioni, ma inizi anche a vedere la perdita di prodotto in due modi. Innanzitutto, lo strato di polarizzazione della concentrazione può catturare le molecole bersaglio e, se diventa troppo spesso, tali molecole potrebbero essere portate via con il retentato quando si scarica la cassetta, invece di essere concentrate. In secondo luogo, alcune molecole bersaglio (come le proteine) possono iniziare ad aggregarsi a concentrazioni elevate e questi aggregati sono spesso abbastanza piccoli da scivolare attraverso la membrana o rimanere intrappolati nel permeato, quindi perderli. Un cliente di vettori virali con cui ho lavorato l'anno scorso utilizzava la nostra cassetta di ultrafiltrazione da 500 KD per concentrare i vettori AAV: hanno spinto la concentrazione del feed a 1e13 genomi vettoriali per ml, che è ben oltre la nostra raccomandazione di 2e12. La loro resa è stata solo del 45%, contro l'82% ottenuto quando hanno abbassato la concentrazione del mangime al giusto intervallo. Quando abbiamo testato il retentato, abbiamo scoperto che il 30% del vettore bersaglio era bloccato nello strato di polarizzazione della concentrazione e un altro 15% era aggregato e perso. Questo è il tipo di successo che può rendere inutile un intero lotto, soprattutto quando hai a che fare con processi conformi a GMP in cui non puoi semplicemente produrre più prodotti per capriccio.

Aspetta, ma prima di pensare che “una concentrazione di mangime inferiore è sempre meglio”: neanche questo è vero. Se il tuo feed è troppo diluito, stai sprecando tempo e capacità della cassetta. L'UF è più efficiente quando si concentra la soluzione a un livello ragionevole, ma se si inizia con un'alimentazione troppo liquida, si sposta molto più volume del necessario, il che aumenta i costi energetici per il pompaggio e richiede più tempo per raggiungere la concentrazione target. Ad esempio, un cliente del laboratorio che stava concentrando un piccolo campione proteico stava utilizzando una cassetta da 10 KD con una concentrazione di alimentazione di 0,1 mg/ml: stava cercando di arrivare a 10 mg/ml, quindi stava elaborando 100 ml di soluzione per ottenere 10 ml di retentato. Ci sono volute 8 ore, contro le 2 ore in cui hanno concentrato prima il mangime tramite centrifugazione a 0,5 mg/ml, quindi hanno elaborato solo 20 ml. Si tratta di un'enorme differenza in termini di manodopera e tempo, soprattutto se si eseguono più lotti al giorno. La chiave è raggiungere quella fascia media, quella che io chiamo la “finestra di concentrazione” per la tua cassetta e applicazione specifica.

Allora come si fa a capire quella finestra di concentrazione? Non è una soluzione valida per tutti, ma ci sono alcune regole pratiche che condividiamo con tutti i nostri clienti. Innanzitutto, controlla il MWCO della tua cassetta: una cassetta con un MWCO più alto (come 500 KD) di solito può gestire una concentrazione di alimentazione più elevata rispetto a una con MWCO inferiore (come 30 KD), perché i pori sono più grandi, quindi la polarizzazione è meno problematica. NostroSerie di cassette-TFF-filtrazioneLa pagina presenta intervalli di concentrazione specifici per ciascuna cassetta, ma come regola generale non superare mai il 10–15% di solidi totali per la maggior parte delle applicazioni proteiche e il 5–10% per le piccole molecole. In secondo luogo, testa il tuo mangime per le impurità: se il tuo mangime contiene molti detriti o aggregati, hai bisogno di una concentrazione di mangime inferiore per evitare incrostazioni, indipendentemente da quale sia la molecola target. In terzo luogo, esegui prima test su piccola scala, non limitarti a passare alla produzione completa. Un test di 100 ml o 1 litro ti dirà esattamente quale flusso ottieni, quanto velocemente si formano le incrostazioni e quale resa puoi aspettarti, in modo da non sprecare prodotto prezioso.

Un'altra cosa che ho notato nel corso degli anni è che la concentrazione del mangime interagisce con altri parametri di processo, come la portata tangenziale e la pressione transmembrana (TMP). Non è come regolare la concentrazione nel vuoto: se hai un'elevata concentrazione di alimentazione, puoi compensare un po' aumentando la velocità del flusso incrociato, che spazza via lo strato di polarizzazione dalla superficie della membrana, e aumentando il TMP (ma non troppo, perché il TMP può causare la compattazione dello strato di polarizzazione). Ma questo è un atto di equilibrio: un flusso incrociato più elevato significa più energia e un TMP più elevato può portare a danni alla membrana se non stai attento. Consigliamo sempre ai clienti di eseguire test parametrici completi che includano la concentrazione del mangime, perché modificarne uno può confondere gli altri. Ad esempio, un cliente una volta ha provato a correggere un calo di flusso dovuto ad un'elevata concentrazione di alimentazione aumentando il TMP e ha finito per compattare la membrana, quindi le analisi successive avevano un flusso ancora più basso. Ecco perché nella nostra azienda non vendiamo solo cassette: aiutiamo i nostri clienti a risolvere questi problemi di processo, perché abbiamo visto quasi tutti gli errori che si possono commettere con la concentrazione del mangime.

Parliamo anche degli effetti a lungo termine, perché la concentrazione del mangime non influisce solo su una singola corsa, ma influisce anche sulla durata della cassetta. Se utilizzi alimenti eccessivamente concentrati, crei molte più incrostazioni, il che significa che devi pulire la cassetta più spesso e agenti detergenti più aggressivi (come pH o temperatura più elevati) per eliminare l'accumulo. Nel corso del tempo, questa pulizia aggressiva degrada la membrana, quindi la cassetta contiene meno passaggi prima di dover essere sostituita. Ho avuto un cliente che utilizzava la nostra cassetta per fogli piani e al quinto ciclo ha dovuto sostituirla a causa di forti incrostazioni, mentre un altro cliente che utilizzava la stessa cassetta alla giusta concentrazione di alimentazione eseguiva più di 15 cicli. Si tratta di un'enorme differenza di costo quando si utilizzano le cassette ogni settimana rispetto a ogni mese.

Ora diventiamo pratici: cosa dovresti fare effettivamente se la concentrazione del tuo mangime è ridotta? Innanzitutto, misuralo correttamente. Molti clienti si affidano allo “spessore visivo” della soluzione, il che è estremamente impreciso. Utilizza un misuratore Brix per i prodotti alimentari o un misuratore di assorbanza (come A280 per le proteine) per ottenere una concentrazione precisa. Quindi, regola l'alimentazione diluendola (se è troppo alta) o concentrandola ulteriormente con una fase di pre-elaborazione più piccola (come la filtrazione a flusso tangenziale con una cassetta diversa o la centrifugazione) se è troppo bassa. Se hai a che fare con un mangime unico nel suo genere, come un biologico personalizzato, rivolgiti al nostro team: abbiamo specialisti di applicazioni che possono aiutarti a progettare un processo su misura per la concentrazione del tuo mangime, sia che si tratti di scegliere il giusto MWCO (come 30KD anziché 500KD), regolare il flusso incrociato o individuare il tempo di esecuzione migliore.

Non posso sottolineare abbastanza quanto piccole modifiche per alimentare la concentrazione possano cambiare l'intero processo UF. Non è un dettaglio noioso: è la differenza tra una corsa che raggiunge tutti i tuoi obiettivi di rendimento e di timeline e una corsa che ti lascia a dover risolvere i problemi per giorni, sprecando prodotto e denaro. Abbiamo costruito il nostroUltrafiltrazione a cassettelinea per essere flessibile, con opzioni per diversi MWCO (come il nostroCassette di ultrafiltrazione da 30kdECassette di ultrafiltrazione da 500KD), progetti di fogli piatti e configurazioni della serie TFF, perché sappiamo che il feed di ogni cliente è diverso. Se hai problemi di concentrazione del mangime o vuoi semplicemente rendere più efficiente il tuo processo UF, siamo qui per aiutarti: abbiamo lavorato con migliaia di clienti per ottenere le giuste finestre di concentrazione e possiamo fare lo stesso per te. Non lasciare che un piccolo dettaglio come la concentrazione del mangime rovini le tue corse: contatta il nostro team per saperne di più sull'ottimizzazione del tuo processo oggi stesso.

Riferimenti

1. Belfort, G., Davis, RH e Zydney, AL (1994). Il comportamento delle sospensioni e delle soluzioni macromolecolari nella microfiltrazione a flusso tangenziale. Giornale di scienza delle membrane, 96(1–2), 1–58.
2. Charcosset, C. (2007). Polarizzazione idrodinamica e concentrazione nell'ultrafiltrazione: una revisione. Desalinizzazione, 211(1–3), 108–122.
3. Zydney, AL (2018). Filtrazione a flusso tangenziale per processi biofarmaceutici. Opinione attuale in ingegneria chimica, 20, 109–115.
4. Mulder, M. (1996). Principi di base della tecnologia delle membrane (2a ed.). Editori accademici Kluwer.