Applicazione diUltrafiltrazione inExestrazione diNnaturaleCcollagene

 

Ⅰ.Cos'è il collagene

Il collagene è un biopolimero, il componente principale del tessuto connettivo degli animali e anche la proteina funzionale più abbondante e ampiamente distribuita nei mammiferi, rappresentando il 25%-30% delle proteine ​​totali e addirittura oltre l'80% in alcuni. organismi. Svolge il ruolo di legare il tessuto nelle cellule animali.

Secondo la misurazione, un adulto ha circa 3 kg di collagene nel suo corpo, presente principalmente nella pelle, nelle ossa, negli occhi, nei denti, nei tendini, negli organi interni (compresi cuore, stomaco, intestino e vasi sanguigni) e in altre parti del corpo umano. La sua funzione è quella di mantenere la morfologia e la struttura della pelle e degli organi, ed è anche un'importante materia prima per la riparazione dei tessuti danneggiati.

II. Estrazione del collagene dalle squame della carpa erbivora mediante ultrafiltrazione

1. Materiali e metodi

1.1 Campioni di prova

Estratto acquoso di collagene grezzo.

1.2 Metodi di prova

1.2.1 Processo di ultrafiltrazione

1.2.2 Determinazione del processo di prefiltrazione

In questo test, il processo di prefiltrazione ottimale viene determinato attraverso l'analisi comparativa del metodo di filtrazione sotto vuoto e del metodo di microfiltrazione. I metodi di prova specifici sono i seguenti:

① L'estratto acquoso di collagene grezzo viene filtrato mediante un metodo di filtrazione sotto vuoto con carta da filtro per rimuovere le particelle sospese e le impurità nell'estratto acquoso.

② L'estratto acquoso di collagene grezzo viene filtrato con una membrana di microfiltrazione da 0,2 μm per rimuovere sostanze insolubili, impurità, ecc. nell'estratto acquoso.

1.2.3 Scelta della dimensione dei pori della membrana di ultrafiltrazione

Durante la purificazione, la dimensione dei pori della membrana di ultrafiltrazione è 100 kDa.

1.2.4 Esperimento a fattore singolo del processo di purificazione mediante ultrafiltrazione

L'estratto acquoso del collagene grezzo viene purificato mediante tecnologia di ultrafiltrazione. Studia l'esperimento a fattore singolo sull'effetto della pressione operativa, della temperatura operativa e del pH sulla ritenzione del collagene. Dopo aver avviato l'apparecchiatura di ultrafiltrazione per un periodo di tempo, studiare l'effetto di vari fattori sul tasso di ritenzione del collagene.

1.2.5 Formula di calcolo

2. Risultati e analisi

2.1 Analisi del processo di prefiltrazione

Vedere la tabella seguente per i risultati del confronto del metodo di filtrazione sotto vuoto e del metodo di microfiltrazione.

Metodo di filtrazione	Concentrazione della soluzione prima della filtrazione/(g/L)	Concentrazione della soluzione dopo la filtrazione/(g/L)	Fenomeni sensoriali
metodo di filtrazione sotto vuoto	0.45	0.35	La soluzione è limpida al termine della filtrazione, ma diventa torbida dopo essere rimasta per un periodo di tempo.
metodo di microfiltrazione	0.45	0.42	La soluzione è limpida al termine della filtrazione e rimane limpida dopo essere stata lasciata per un periodo di tempo

 

Dalla tabella si può vedere che sia il metodo di filtrazione sotto vuoto che il metodo di microfiltrazione possono rimuovere le impurità e i solidi insolubili nella soluzione, ma il metodo di microfiltrazione ha un migliore effetto protettivo sulle proteine, ovvero la perdita non è significativa e il metodo di filtrazione sotto vuoto può causare perdite di proteine. Inoltre, il filtrato è torbido dopo essere stato posto per un periodo di tempo mediante filtrazione sotto vuoto, mentre la microfiltrazione è ancora limpida e trasparente, quindi la microfiltrazione viene selezionata come processo di pretrattamento dell'ultrafiltrazione.

2.2 Test a fattore singolo del processo di ultrafiltrazione

2.2.1 Effetto della pressione di ultrafiltrazione sul tasso di ritenzione

Alla condizione di temperatura di 40 gradi e pH 9.0, studia gli effetti di diverse pressioni di ultrafiltrazione (0.07MPa, 0.{ {11}}9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa e 0,15MPa) sul tasso di ritenzione proteica. I risultati sono mostrati nella figura seguente.

 

Come si può vedere dalla figura sopra, con l'aumento della pressione di esercizio, la velocità di intercettazione delle proteine ​​diminuisce gradualmente. A {{0}}.07MPa, il tasso di ritenzione proteica è del 96,53%, quando la pressione operativa è 0,15 MPa, il tasso di ritenzione proteica è dell'84,38%. Ciò avviene perché la separazione delle sostanze mediante ultrafiltrazione è guidata dalla differenza di pressione. In quell'intervallo di bassa pressione operativa, piccole sostanze molecolari possono passare rapidamente attraverso la membrana, ma le sostanze macromolecolari possono essere intrappolate dalla membrana di ultrafiltrazione e accumularsi sulla superficie della membrana e, al momento, la superficie della membrana e il sistema acquoso estrarre la differenza di concentrazione dalla forma per causare la resistenza alla polarizzazione della differenza di concentrazione; tuttavia, con l'aumento della pressione, la resistenza alla polarizzazione della concentrazione aumenta gradualmente e la differenza di concentrazione tra la superficie della membrana e l'estratto acquoso raggiunge l'equilibrio. Quando la pressione supera questo equilibrio, uno strato di gel potrebbe essere scritto sulla superficie della membrana (il che era coerente con la teoria della polarizzazione della concentrazione e dello strato di gel formato durante l'ultrafiltrazione). La pressione continua ad aumentare, lo spessore dello strato di gel aumenta e la proteina rimasta sulla superficie della membrana aumenta, con conseguente basso tasso di ritenzione. Per garantire l'effetto di separazione della membrana, il parametro di pressione operativa ottimale è 0,07 MPa.

2.2.2 Effetto della temperatura sul tasso di ritenzione proteica

In condizioni di pressione {{0}}.11MPa, pH 9.0, studia gli effetti di diverse temperature (25 gradi, 30 gradi, 35 gradi, 40 gradi e 45 gradi) sulla ritenzione proteica. I risultati sono mostrati nella figura seguente.

 

Come mostrato nella figura sopra, con l'aumento della temperatura, il tasso di ritenzione della membrana di ultrafiltrazione aumenta gradualmente e raggiunge il massimo a 45 gradi, con un tasso di ritenzione del 97,01%. Perché la viscosità del collagene è strettamente correlata alla temperatura: quando la temperatura è più bassa, la viscosità del collagene è maggiore e quindi è facile che il collagene formi resistenza sulla superficie della membrana, con conseguente basso tasso di ritenzione. Quando la temperatura aumenta, la viscosità del collagene diminuisce e l'interazione tra le molecole di collagene si indebolisce, così che la velocità di trasferimento di massa aumenta e la polarizzazione della concentrazione viene indebolita, aumentando così il tasso di ritenzione. Un altro motivo per l'aumento del tasso di ritenzione è che la temperatura aumenta, aumenta di conseguenza la solubilità del collagene e si riduce il fenomeno del blocco del collagene sulla membrana. Pertanto, la temperatura ottimale per l'ultrafiltrazione è di 45 gradi.

2.2.3 Effetto del pH sulla ritenzione proteica

In condizioni di pressione {{0}}.11MPa e temperatura di 40 gradi, studia gli effetti di diverse condizioni di pH, vale a dire pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 e pH=10.0, sul tasso di ritenzione . I risultati sono mostrati nella figura seguente.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, il tasso di ritenzione aumenta gradualmente con l'aumento del pH. Questo perché la membrana di ultrafiltrazione è una membrana di polietere d'acero con carica negativa, il collagene con carica negativa in condizioni alcaline, le molecole di collagene caricate negativamente e la membrana di ultrafiltrazione con la stessa carica formano uno stato mutuamente esclusivo, in modo che le molecole di collagene non siano facili da rimanere in superficie della membrana, non è facile bloccare la membrana, quindi il pH ottimale dell'ultrafiltrazione è 8-10.

2.3 Ottimizzazione del processo di ultrafiltrazione e convalida dei risultati

L'analisi del software Design-Expert8.05 mostra che i parametri di processo ottimali sono i seguenti: pressione operativa 0.14MPa, temperatura operativa 40,98 gradi e pH della soluzione=9.43. In queste condizioni il tasso di ritenzione è stato del 92,551%. Considerando l'operatività dei parametri effettivi, la pressione operativa è 0,14 MPa, la temperatura operativa è 40 gradi e il valore pH del liquido di alimentazione è 9,50 nelle condizioni di ultrafiltrazione. La verifica sperimentale viene avviata dopo che il sistema del dispositivo di ultrafiltrazione ha iniziato ad essere stabile. Il risultato del tasso di fidelizzazione ottenuto è (92,61 0,1)% (n=3). Il valore previsto dell'equazione è sostanzialmente simile al valore misurato, il che indica che il risultato del parametro condizionale previsto è conforme al risultato condizionale effettivo.

2.4 Risultati dell'analisi dell'elettroforesi

Il collagene purificato viene analizzato mediante elettroforesi SDS-PAGE e i risultati sono mostrati nella figura seguente.

Come mostrato nella figura sopra, la corsia 1 è il collagene purificato in questo esperimento e la corsia 2 è il campione di collagene standard del tendine del polpaccio. Dall'elettroforesi SDS-PAGE si potrebbe vedere che la proteina di collagene proposta in questo esperimento potrebbe essere identificata come collagene, ma i confini apparentemente indistinti della catena peptidica a1 e della catena peptidica a2 non sono chiari. Dall'elettroforesi risulta chiaro che non sono presenti altre bande proteiche e si può concludere che la purezza del collagene purificato è elevata.