Precauzioni per l'uso del tubo di ultrafiltrazione
(1) Selezionare il tubo di ultrafiltrazione appropriato. Generalmente, il peso molecolare da mantenere non deve essere superiore a 1/3 del peso molecolare della proteina bersaglio. Ad esempio, se il peso molecolare della proteina bersaglio è 35kDa, è possibile selezionare il tubo di ultrafiltrazione con peso molecolare 10kDa. Se il peso molecolare della proteina bersaglio è di circa 10kd, è possibile utilizzare un tubo di ultrafiltrazione con un peso molecolare di 3KD. Leggere attentamente il manuale di istruzioni e prestare attenzione alla diversa tolleranza della membrana di ultrafiltrazione a varie sostanze chimiche.
(2) L'ultrafiltrazione appena acquistata è asciutta. Aggiungere acqua ultrapura prima dell'uso e l'acqua passerà completamente attraverso la membrana. Pre raffreddarlo in un bagno di ghiaccio o frigorifero per alcuni minuti. Quindi versare l'acqua e aggiungere la soluzione proteica. La quantità aggiunta non deve superare la linea bianca sulla parte superiore del tubo. L'operazione dovrebbe essere leggera. Prima di aggiungere la soluzione proteica, il tubo di ultrafiltrazione deve essere inserito sul ghiaccio per il preraffreddamento.
(3) Equilibrio. Sia la massa che il centro di gravità dovrebbero essere bilanciati. Si noti che la velocità e l'accelerazione non dovrebbero essere troppo veloci, altrimenti la membrana di ultrafiltrazione sarà direttamente danneggiata. Avviare l'ultrafiltrazione centrifuga (preraffreddamento della centrifuga a 4 gradi). Dopo che il numero di giri di diverse centrifughe è stato convertito in G, è diverso. Regolare l'accelerazione della centrifuga sulla marcia più bassa per ridurre la pressione sulla membrana. Si noti che è necessario attendere che la centrifuga raggiunga la velocità target prima di lasciare la centrifuga, altrimenti quando c'è un problema con la centrifuga, non è possibile affrontarlo per la prima volta. La direzione della membrana e dell'albero rotante deve essere regolata secondo le istruzioni (nel caso di centrifuga rotante angolare, la membrana è perpendicolare all'albero). Nell'uso pratico, la velocità è generalmente inferiore a quella del manuale, il che può prolungare la durata del tubo centrifugo.
(4) Quando è concentrato al restante 1 ml, prendere la soluzione tampone a 50ul e aggiungere 10ul per fluire attraverso per vedere se diventa blu, in modo da giudicare se il tubo di ultrafiltrazione perde proteina. Se il tubo perde, versare lo strato superiore e scorrere attraverso il nuovo tubo e avviare l'ultrafiltrazione. Per giudicare con precisione se il tubo perde, centrifugare con 5 mgml di BSA per 10 minuti, quindi prendere il flusso, eseguire la colla proteica o Bradford per una misurazione approssimativa e continuare ad aggiungere la soluzione proteica rimanente per la concentrazione (operare sul ghiaccio per evitare che la proteina venga riscaldata) fino a quando non vengono aggiunte tutte le soluzioni concentrate. Prestare attenzione al fatto che la precipitazione delle proteine si verifichi durante la centrifugazione, con conseguente blocco del tubo. Se si verifica una precipitazione, determinare la causa specifica della precipitazione, se la concentrazione proteica è troppo alta o il tampone è inappropriato; Il primo può essere risolto mediante ultrafiltrazione simultanea con più tubi di ultrafiltrazione per ridurre la concentrazione. Quest'ultimo è quello di cambiare diverse soluzioni tampone fino a quando la proteina non precipita.
(5) I passaggi precedenti sono utilizzati per concentrare le proteine. Se si desidera modificare il tampone, quando la soluzione proteica totale è concentrata a circa 1 ml, aggiungere delicatamente un nuovo tampone (ultrafiltrazione attraverso la membrana di ultrafiltrazione da 0,22um) e quindi concentrarsi a circa 1 ml per tre volte consecutive. Il volume finale dell'ultima concentrazione dipende dalla concentrazione proteica richiesta, che generalmente non è superiore a 500ul, oppure può essere concentrata a meno di 200ul. Secondo la concentrazione di volume di almeno 10 volte ogni volta, può raggiungere più di 1000 volte tre volte, il che può fondamentalmente raggiungere lo scopo di cambiare il buffer.
