Processo di concentrazione/ultrafiltrazione a valle: come prevenire efficacemente la permeazione e la perdita delle proteine ​​bersaglio

Processo di concentrazione di ultrafiltrazione/diafiltrazione a valle: come prevenire efficacemente la permeazione e la perdita delle proteine ​​​​bersaglio

Nei processi di purificazione a valle per proteine ​​ricombinanti, emoderivati ​​e altri prodotti biologici, l'ultrafiltrazione/diafiltrazione (UF/DF) viene utilizzata per la concentrazione delle materie prime, lo scambio di tamponi e la rimozione di sali e piccole-impurità molecolari. La separazione viene ottenuta mediante setacciatura della membrana: grandi molecole come gli anticorpi monoclonali (mAb) vengono trattenute dalla membrana, mentre sali, endotossine, proteine ​​della cellula ospite libera (HCP) e altre impurità di piccole-molecole passano attraverso la membrana e vengono rimosse nel permeato. Durante l'espansione del processo-, può facilmente verificarsi la perdita di proteine ​​target attraverso la membrana, riducendo direttamente la resa e aumentando i costi del batch. In alcune condizioni operative, è possibile che vengano rilevate proteine ​​nel permeato, richiedendo una rapida determinazione per stabilire se i componenti fuoriusciti siano mAb bersaglio intatti, aggregati degradati/frammentati o proteine ​​della cellula ospite. Questo articolo è diviso in due parti principali: esamina gli approcci tradizionali al controllo-del processo e, in combinazione con il Design of Experiments (DOE), stabilisce una solida finestra di processo, supportata da molteplici metodi analitici per determinare l'identità delle proteine ​​rilevate nel permeato.

 

 

I. Cause principali della permeazione delle proteine ​​bersaglio attraverso la membrana durante l'UF/DF

1. Pressione transmembrana eccessiva (TMP)
Quando la differenza di pressione attraverso la membrana è troppo elevata, la resistenza del solvente aumenta, forzando alcune proteine ​​monomeriche nel permeato. Durante l'aumento di scala-, il serbatoio di alimentazione contiene un volume maggiore di materiale e le fluttuazioni di pressione nelle tubazioni sono più pronunciate, rendendo più probabile una sovrapressione transitoria rispetto a quella su scala di laboratorio.

2. Portata tangenziale non corretta
Se la portata è troppo bassa, sulla superficie della membrana si forma uno strato denso di concentrazione-polarizzante e la concentrazione proteica locale potrebbe superare la soglia di tolleranza della membrana. Se la velocità di flusso è troppo elevata, lo stress di taglio può causare la scissione strutturale del mAb, generando frammenti proteici più piccoli che possono passare liberamente attraverso i pori della membrana.

3. Concentrazione proteica eccessivamente elevata nella materia prima
Quando la concentrazione proteica nel mangime è troppo elevata, le proteine ​​si accumulano sulla superficie della membrana e alcune proteine ​​monomeriche possono essere trasportate nel permeato. Questo è un problema comune nella produzione su larga-scala.

4. pH o conduttività fuori dall'intervallo del processo
I cambiamenti nelle caratteristiche di carica della proteina possono ridurne il raggio di idratazione e la dimensione apparente delle particelle, con conseguente permeazione anomala della membrana.

5. Invecchiamento della cassetta della membrana, flusso diffusivo elevato o pre-condizionamento insufficiente
I difetti fisici nella cassetta della membrana possono causare direttamente la perdita di proteine ​​e rappresentare un rischio-correlato all'apparecchiatura. Il CIP ripetuto con soluzioni fortemente alcaline può danneggiare gradualmente il materiale della membrana in polietersulfone (PES).

6. Volume di diafiltrazione eccessivo
Durante la diafiltrazione prolungata, il lavaggio continuo con solvente può portare via gradualmente piccole quantità di proteina monomerica.

 

II. Misure pratiche tradizionali per prevenire la permeazione e la perdita delle proteine ​​bersaglio

(A) Controllo dei parametri di processo

1. Controllare la pressione transmembrana (TMP)
Definisci un limite di avviso di pressione superiore e stabilisci allarmi di interblocco per prevenire impatti transitori di alta-pressione sullo strato di membrana. Dopo aver determinato i parametri di base su piccola scala, ridurre la pressione operativa sicura durante l'incremento della produzione e riservare un intervallo di tolleranza del processo appropriato.

2. Ottimizzare la portata tangenziale
Stabilire uno strato limite stabile e ridurre la polarizzazione della concentrazione sulla superficie della membrana attraverso il flusso incrociato, riducendo così al minimo l'accumulo di proteine ​​sulla superficie della membrana alla fonte.

3. Limitare la concentrazione finale dopo la concentrazione
Definire un limite di concentrazione basato sulle proprietà fisico-chimiche della proteina ed evitare un'eccessiva concentrazione di mangime. Per i mAbs, la concentrazione finale di routine generalmente non supera i 50 mg/ml; per alcuni mAb inclini all'aggregazione-, la concentrazione dovrebbe essere ulteriormente ridotta.

4. Controllare il pH e la conduttività dell'alimentazione
Mantieni una dimensione stabile delle particelle idratate della proteina ed evita la contrazione molecolare causata da disturbi dell'acido/base o della forza ionica-.

(B) Attrezzature e controlli operativi

1. Eseguire il test di integrità della cassetta della membrana prima di ciascun lotto
Condurre un test del punto di bolla-prima della produzione di ciascun lotto per identificare le fibre della membrana rotte. Le cassette con membrana danneggiate devono essere scartate immediatamente per evitare perdite continue di proteine.

2. Standardizzare la procedura di pulizia CIP
Controllare la concentrazione di NaOH e il tempo di contatto. Dopo la pulizia fortemente alcalina, equilibrare completamente il materiale della membrana per ridurre il rischio di deformazione dei pori della membrana.

3. Utilizzare la diafiltrazione a fasi
Utilizza uno scambio di buffer di grande-volume durante la fase iniziale per rimuovere i sali e rallenta la velocità del flusso di diafiltrazione man mano che l'endpoint si avvicina per ridurre il trascinamento e la perdita di proteine.

 

III. Definizione di uno spazio di progettazione del processo tramite DOE (caratterizzazione del processo QbD; applicabile alla presentazione IND)

1. Screening dei fattori
Schermare cinque parametri chiave del processo UF/DF (P): pressione transmembrana, portata di alimentazione, concentrazione proteica iniziale, pH di alimentazione e temperatura operativa.
Variabili di risposta: resa trattenuta, contenuto proteico nel permeato, flusso della membrana e percentuale di aggregati ad alto peso-molecolare-.

Attraverso l'analisi della significatività, identificare i fattori chiave che contribuiscono alla perdita di proteine.

2. Modellazione delle superfici di risposta
Selezionare i quattro parametri con la massima significatività per costruire una superficie di risposta e analizzare le interazioni tra i parametri. In molte condizioni operative, un singolo parametro può rimanere entro il suo intervallo qualificato, mentre la combinazione di due parametri può provocare permeazione proteica. Tali effetti di interazione non possono essere identificati attraverso i tradizionali esperimenti un-fattore-alla-a-volta. In base al modello, definire uno spazio di progettazione utilizzabile. Finché i parametri del processo rimangono entro questo intervallo, è possibile garantire un'efficace ritenzione proteica mentre le impurità vengono rimosse mediante diafiltrazione.

3. Sfida nel caso peggiore-(richiesto per la caratterizzazione del processo)
Seleziona i parametri di processo agli estremi dei limiti operativi per simulare la variabilità della produzione: TMP massimo, portata minima del flusso incrociato e concentrazione proteica limite-superiore. Verificare che anche in condizioni operative estreme non si verifichi una perdita di proteine ​​target su larga-scala, soddisfacendo così i requisiti di revisione CMC.

 

IV. Metodi analitici multipli per identificare le proteine ​​rilevate nel permeato e distinguere il mAb bersaglio, i frammenti di degradazione e l'HCP

Sulla base dell’efficienza analitica, dei costi e degli scenari di presentazione normativa, i metodi possono essere suddivisi in due categorie: screening rapido e test di conferma. I metodi rapidi dovrebbero avere la priorità per il monitoraggio di routine dei processi; quando si verificano deviazioni anomale, dovrebbero essere utilizzati metodi di identificazione precisi.

1. Spettrofotometria UV (screening online rapido; preferibile per il monitoraggio di routine-in officina)
Raccogliere il permeato e misurarne l'assorbanza A280. Ciò può solo determinare se la proteina è presente nel permeato e non può distinguere la specie proteica. Viene utilizzato principalmente per il monitoraggio di routine dei processi. Un valore A280 in continuo aumento indica un peggioramento della perdita di proteine ​​e richiede l'immediata sospensione della diafiltrazione e un'indagine del processo.

2. Elettroforesi SDS-PAGE (metodo di identificazione qualitativa più comunemente utilizzato)
Utilizza l'elettroforesi riducente e non-riducente e confronta le posizioni delle bande con quelle del mAb target nella materia prima:
1) Se la posizione della banda è completamente coerente con il mAb target, il mAb intatto ha permeato la membrana.
2) Se compaiono bande di peso-molecolare-inferiore, la proteina ha subito la scissione idrolitica, generando frammenti di mAb.
3) Se le bande sono sparse con più bande miscellanee, la maggior parte sono proteine ​​della cellula ospite (HCP) provenienti da cellule ospiti di E. coli/CHO anziché il prodotto target.

3. Cromatografia di esclusione dimensionale-ad alte prestazioni (HPSEC)
Separare i componenti in base alle dimensioni molecolari e confrontare i loro tempi di eluizione con quelli del cromatogramma della materia prima:
- Un picco principale con lo stesso tempo di ritenzione del mAb indica una proteina bersaglio intatta.
- Un picco che eluisce prima indica aggregati/frammenti ad alto peso{{1}molecolare-.
- Un picco che eluisce successivamente indica frammenti di degradazione a basso peso-molecolare-.
- L'assenza di un picco principale caratteristico indica proteine ​​​​impurità HCP.
Questo metodo può fornire dati quantitativi e può essere incluso nei rapporti di indagine sulle deviazioni del processo; ha un'elevata accettazione nei materiali di presentazione clinica.

4. Test del kit ELISA per la proteina cellulare ospite- dell'HCP
Se viene rilevata una proteina nel permeato, il risultato ELISA è elevato e l'HPSEC non mostra alcun picco mAb caratteristico, si può sostanzialmente determinare che il materiale fuoriuscito è costituito da proteine ​​della cellula ospite- CHO. Ciò indica una rimozione incompleta delle impurità durante la purificazione a monte; le impurità vengono eliminate durante la fase UF/DF e non rappresentano una perdita di prodotto.

5. Verifica della cromatografia di affinità (cromatografia della proteina A)
La proteina A lega specificamente la regione Fc dei mAbs. Caricare il campione di permeato sulla colonna: la comparsa di un caratteristico picco di eluizione indica la presenza dell'anticorpo bersaglio intatto; l'assenza di un picco di eluizione dimostra che le proteine ​​nel permeato sono tutte proteine ​​impure.

6. Spettrometria di massa (LC-MS) (tracciabilità approfondita; utilizzata per l'analisi delle principali deviazioni del processo)
La LC-MS può analizzare direttamente la sequenza di aminoacidi e determinare con precisione l'origine della proteina. Viene utilizzato principalmente per l'analisi di deviazioni difficili o insolite e non viene utilizzato come test di controllo di routine nel-processo.

V. Azioni correttive corrispondenti a diversi risultati analitici

1. mAb target intatto rilevato nel permeato
Ridurre la pressione transmembrana e la concentrazione finale dopo la concentrazione; restringere l'intervallo operativo del processo in base ai risultati del DOE; e controllare l'integrità della cassetta della membrana.

2. Frammenti di degradazione degli anticorpi rilevati nel permeato
Analizzare lo stress da taglio durante tutto il processo e i pH estremi; ottimizzare la fase di inattivazione virale a monte per ridurre la scissione delle proteine.

3. Nel permeato sono state rilevate solo impurità HCP
Non è richiesta alcuna regolazione dei parametri UF/DF. Riconduci il problema alle fasi cromatografiche precedenti e migliora la rimozione delle impurità durante la cromatografia di affinità e a scambio ionico-.

 

VI. Riepilogo

Per prevenire la fuoriuscita di proteine ​​durante l'UF/DF, il controllo del processo tradizionale si basa sull'esperienza storica per definire i parametri dei singoli punti, che possono affrontare adeguatamente solo una produzione stabile su piccola scala-. Per garantire prestazioni stabili durante l'incremento graduale del processo-, è necessario utilizzare la caratterizzazione del processo basata su DOE- per stabilire uno spazio di progettazione del processo con tolleranza sufficiente. Il controllo dei parametri basato sugli intervalli-può compensare la variabilità della produzione. Una volta rilevata la proteina nel permeato, un semplice sistema di rilevamento UV può fornire un avviso iniziale, seguito da elettroforesi, HPSEC ed ELISA per la tracciabilità e l'identificazione. Ciò consente una differenziazione accurata tra il prodotto target e le impurità della cellula ospite-, consentendo un'indagine mirata della causa principale-e azioni correttive. Questa è anche una componente di ricerca standardizzata attualmente inclusa nella documentazione CMC per i progetti mAb.