Applicazione dell'ultrafiltrazione nella produzione del vaccino contro la rabbia umana

Al fine di promuovere l'applicazione dell'ultrafiltrazione nella produzione del vaccino antirabbico umano, è stata utilizzata una cassetta a membrana di ultrafiltrazione da 300 kDa per concentrare la soluzione di raccolta del virus della rabbia e rilevare il recupero dell'antigene, il tasso di rimozione dell'endotossina e il tasso di rimozione della proteina ospite dopo l'ultrafiltrazione. I risultati hanno mostrato che, sotto la pressione appropriata, la soluzione di raccolta del virus della rabbia è stata concentrata 80 volte, eluita 25 volte, il tasso di recupero dell'antigene era 86,2%, il tasso di rimozione dell'endotossina batterica era 87,5% ~ 88,7% e il tasso di rimozione della proteina ospite è stato del 91,6%.

 

Prefazione

 

La rabbia è un'antica e tradizionale malattia zoonotica causata dal virus della rabbia (RV), con un tasso di mortalità fino al 100%. Al momento non esiste alcun trattamento efficace per la post-esposizione (cioè i danni alla pelle e alle mucose) oltre al vaccino di emergenza e alla vaccinazione con immunoglobuline. La principale fonte di rabbia negli esseri umani sono i morsi di animali malati o potenzialmente infetti (principalmente cani). Il tasso di mortalità della rabbia in Cina è al secondo posto nel mondo e la rabbia è uno dei problemi che minacciano la sicurezza sanitaria pubblica nel nostro Paese. La glicoproteina capsulare del virus della rabbia, che è l’unico antigene chiave che induce la produzione di anticorpi neutralizzanti protettivi, è stata al centro della ricerca e dello sviluppo di nuovi vaccini e di nuove tecnologie di diagnosi e trattamento del virus della rabbia.

 

Il virus della rabbia appartiene al genere virus della rabbia della famiglia dei rabdovirus. La forma del nucleocapside è elastica, il nucleocapside è elicoidale simmetrico e la superficie ha un involucro contenente RNA a filamento singolo. È l'agente patogeno che causa la rabbia. Il virus della rabbia ha due antigeni principali: uno è l'antigene glicoproteico sulla membrana esterna del virus, che può legarsi al recettore dell'acetilcolina per rendere il virus neurotossico e produrre anticorpi neutralizzanti e anticorpi che inibiscono l'emoagglutinazione nel corpo, e gli anticorpi neutralizzanti hanno un effetto protettivo; L'altro è l'antigene riboproteico interno, che può indurre l'organismo a produrre anticorpi leganti il ​​complemento e precipitina, e non ha alcun effetto protettivo.

 

L'endotossina è un tipo di sostanza lipopolisaccaridica (LPS), che ha resistenza al calore e stabilità chimica e non è facile da distruggere. Se nel vaccino è presente una certa concentrazione di endotossina, ciò causerà febbre grave e persino la morte dopo la vaccinazione, quindi il contenuto di endotossina nel vaccino dovrebbe essere ridotto il più possibile. L'edizione del 2005 della Farmacopea cinese (Parte III) ha stabilito che il valore di controllo dell'indice qualificato dell'endotossina del vaccino contro la rabbia non dovrebbe essere superiore a 100 EU/dose. Con il rapido sviluppo della tecnologia di separazione a membrana, l'applicazione della tecnologia di separazione a membrana di ultrafiltrazione per ridurre il contenuto di endotossina nei vaccini sta diventando sempre più diffusa nell'industria farmaceutica.

 

Un vaccino contro la rabbia è un vaccino contro la rabbia. Di solito esistono tre tipi di vaccini contro la rabbia, tra cui il vaccino a cellule Vero purificate, il vaccino a cellule diploidi umane e il vaccino a coltura cellulare primaria. Il vaccino contro la rabbia viene prodotto inoculando il virus fissato del virus della rabbia nella matrice cellulare, dopo coltura, raccolta, concentrazione, inattivazione, purificazione e aggiunta di stabilizzante appropriato. La funzione principale del vaccino contro la rabbia è quella di stimolare l'organismo a produrre una risposta immunitaria rapida e produrre anticorpi protettivi contro il virus della rabbia, in modo da prevenire l'infezione causata dal virus e ridurre il rischio di malattia.

 

 

Il processo di produzione del vaccino svolge un ruolo importante nel garantire la qualità del vaccino, in particolare la quantificazione di alcuni indicatori nel processo di produzione è più importante. Nel processo di produzione del vaccino antirabbico umano, la tecnologia di concentrazione dell'ultrafiltrazione è un mezzo necessario per produrre il vaccino antirabbico umano. L'uso di una membrana di ultrafiltrazione con apertura ragionevole per la concentrazione di ultrafiltrazione può rimuovere efficacemente l'endotossina e la proteina ospite e trattenere l'antigene RV, il che favorisce la produzione del vaccino e il miglioramento della qualità. La massa molecolare relativa delle molecole RV è 350 kDa ~ 460 kDa e, in teoria, RV può essere completamente intrappolato mediante concentrazione di ultrafiltrazione utilizzando cassette a membrana con peso molecolare di intercettazione di 100 kDa e 300 kDa. L'endotossina forma spesso una struttura aggregata in diverse soluzioni acquose, a causa del grado di aggregazione, la dimensione molecolare è diversa. La massa molecolare relativa del monomero di endotossina è 10 kDa ~ 20 kDa e la massa molecolare relativa della sua forma di polimerizzazione è 300 kDa ~ 1000 kDa o superiore a 1000 kDa. Sulla base della differenza di peso molecolare, l'antigene RV nel vaccino antirabbico umano è stato trattenuto e l'endotossina e la proteina ospite nel vaccino antirabbico umano sono state rimosse mediante membrana di ultrafiltrazione da 300 kDa.

 

In questo esperimento, una cassetta a membrana di ultrafiltrazione con apertura di 300 kDa e un'area di membrana di 0,11 m2 è stata utilizzata come trattamento di piccoli campioni per concentrare i prodotti intermedi del vaccino antirabbico umano e il flusso di membrana, l'efficienza del trattamento, la concentrazione multipla, l'intercettazione dell'antigene, la rimozione dell'endotossina e sono stati testati la rimozione della proteina ospite.

 

2Metodo materiale

 

2.1 Materiali sperimentali

Virus della rabbia fissato al ceppo CTN-IV; Celle Vero; 0.5M idrossido di sodio; Cassetta con membrana per ultrafiltrazione da 300 kDa (materiale PES, area della membrana 0,11 m²).

 

2.2 Metodi sperimentali

2.2.1 Preparazione della soluzione per la raccolta del virus

Le cellule Vero congelate sono state rianimate in acqua calda a 37 gradi ~ 39 gradi, la sospensione cellulare è stata aspirata e quindi aggiunta al terreno di coltura 199 contenente l'10% di siero di vitello inattivato. Cellule monostrato uniformi sono state coltivate a 37 gradi. Il ceppo CTN-IV è stato inoculato con il virus della rabbia in un rapporto di 0,1 mol/L e coltivato a 37 gradi. Dopo 48 ore, il terreno di coltura è stato scartato ed è stato aggiunto terreno di coltura 199 contenente lo 0,1% di albumina di sangue umano per mantenere la coltura a 33 gradi ~ 35 gradi. Raccogli il veleno della malattia una volta ogni 3d-5d e combina i diversi fluidi di raccolta.

 

2.2.2 Installazione della cassetta della membrana

Installare la cassetta della membrana e collegare il cablaggio come mostrato nella figura seguente.

 

2.2.3 Lavaggio con acqua

Chiudere la valvola di ingresso, la valvola di ritorno e la valvola passante e inserire l'estremità di ritorno e il tubo passante nel serbatoio del liquido di scarico. Riempire il serbatoio di aspirazione con 1 litro di acqua per preparazioni iniettabili.

Aprire le valvole di ingresso e di ritorno, chiudere le valvole passanti, aprire la pompa, pulire la linea di ritorno con l'10% del volume di acqua purificata o acqua per preparazioni iniettabili e mantenere la pressione di ingresso a 0,35 bar (5 psi).

Apri la valvola del filtro, chiudi la valvola di ritorno e utilizza l'acqua di iniezione rimanente per pulire il tubo del filtro, mantenendo il TMP a 0,35 bar.

 

2.2.4 Disinfezione

Chiudere la valvola di ingresso, la valvola di ritorno e la valvola di trasmissione e inserire le linee di ritorno e di trasmissione nel serbatoio del liquido di scarico. Riempire il serbatoio di aspirazione con 2 litri di soluzione detergente.

Aprire le valvole di ingresso e di ritorno, chiudere le valvole passanti, aprire la pompa, pulire la linea di ritorno con 200ml di idrossido di sodio 0,5 M e mantenere la pressione di ingresso a 0,35 bar (5 psi) .

Apri la valvola di passaggio, chiudi la valvola di ritorno e pulisci il tubo di passaggio con un volume di 200 ml di soluzione detergente, mantenendo il TMP a 0,35 bar.

Quindi l'estremità di ritorno e il tubo passante vengono inseriti nel serbatoio del liquido per la pulizia ciclica. Ciclo di pulizia con 1 ~ 1,5 volte la portata tangenziale del processo per 30 minuti.

Scaricare 0,5M di idrossido di sodio e sciacquare con acqua per preparazioni iniettabili secondo 2.2.4 fino alla neutralità.

 

2.2.5 Prova del flusso d'acqua

Aggiungere acqua purificata al serbatoio di aspirazione, misurare e registrare la temperatura dell'acqua nel serbatoio di aspirazione. Inserire l'estremità di ritorno nel serbatoio. Avviare la pompa e regolarne la velocità e la valvola di ritorno per ottenere una differenza di pressione transmembrana di 0,35 bar (5 psi). Utilizzando un cilindro, misurare e registrare la portata all'estremità passante in mL/min. Regolare la velocità della pompa e la valvola di ritorno per ottenere una pressione differenziale transmembrana di 1 bar (15 psi). Utilizzando un cilindro, misurare e registrare la portata all'estremità passante in mL/min.

Per standardizzare il valore del flusso d'acqua, dividere il valore del flusso d'acqua calcolato per la differenza di pressione transmembrana e moltiplicare il fattore di correzione della temperatura nella tabella seguente.

 

2.2.6 Concentrazione di ultrafiltrazione

Lavare l'acqua dal sistema con il tampone superiore. Ciclo per 5 minuti per regolare il pH e la stabilità ionica del sistema. Se è necessario regolare la temperatura, continuare il ciclo fino a quando la temperatura del sistema non sarà stabile.

Aggiungere il liquido di alimentazione al serbatoio di aspirazione, impostare una portata di alimentazione (ad esempio 400 LMH) e testare la portata a diversi valori TMP. Secondo i dati del test, le curve sono state disegnate con TMP come ascissa e Flux come ordinata.

Dirigere il tubo passante in un contenitore o scarico adatto, come serbatoi di raccolta passanti, serbatoi per liquidi di scarto e scarichi di processo.

Registrare il peso iniziale del liquido di alimentazione nel serbatoio di alimentazione, avviare la pompa di alimentazione e far circolare lentamente il liquido di alimentazione per 3 minuti - 4 minuti. Il ricircolo può aiutare a rimuovere l'aria residua nel percorso del flusso, massimizzando così le prestazioni della pellicola.

Aprire la valvola di passaggio, aumentare lentamente la velocità della pompa fino a raggiungere la portata tangenziale ottimale e regolare la valvola di ritorno per ottenere il TMP ottimale del sistema.

Quindi inserire il tubo nel contenitore di raccolta, iniziare a cronometrare quando il liquido entra nel contenitore e registrare la pressione di ingresso e di ritorno a intervalli appropriati e registrare la qualità del liquido nel tempo all'estremità di ritorno e all'estremità passante per calcolare l'istantaneo Portata.

La concentrazione di ultrafiltrazione del campione è completata quando il volume del liquido dell'alimentazione viene ridotto al volume di concentrazione target.

 

2.2.7 Dialisi

Mettere il tubo di aspirazione, il tubo di rifornimento e il tubo di ritorno nel serbatoio di aspirazione, mettere il tubo di trasmissione nel contenitore di raccolta e mettere il contenitore di raccolta sulla bilancia per pulirlo.

Aprire la valvola di ritorno, avviare la pompa di aspirazione, aprire la valvola passante, regolare la velocità della pompa e il TMP sul valore appropriato. Aprire la pompa di rifornimento, mantenere invariato il volume del liquido nel serbatoio di aspirazione e avviare la dialisi di uguale volume. Iniziare a cronometrare quando il liquido entra nel contenitore e registrare la pressione all'estremità di ingresso, all'estremità di ritorno e la massa del liquido nell'intervallo di tempo appropriato e ottenere la portata istantanea tramite calcolo.

 

2.2.8 CIP

Risciacquare innanzitutto con tampone, quindi risciacquare con acqua per preparazioni iniettabili (operazione 2.2.3), quindi pulire con detergente (operazione 2.2.4) e infine risciacquare con acqua per preparazioni iniettabili (operazione 2.2.3).

 

2.2.9 Prova del flusso d'acqua

Il funzionamento è il seguente: 2.4.5.

 

2.2.10 Conservazione della cassetta della membrana

Conservazione a breve termine (meno di 3 giorni), conservare la cassetta della membrana nell'apparecchio e utilizzare la soluzione di conservazione per eseguire cicli da 10 minuti a 15 minuti, chiudere la valvola del sistema, interrompere l'alimentazione alla pompa del liquido e garantire che il serbatoio di ingresso del liquido sia correttamente sigillato.

Se il tempo di conservazione è compreso tra 3 giorni e 1 mese, rimuovere la cassetta della membrana dall'apparecchiatura e sigillarla in un sacchetto di plastica o in un altro contenitore ermetico. Aggiungi circa 50 ml-100 ml della soluzione di conservazione in un sacchetto di plastica o in un contenitore ermetico e sigillalo. Oppure può essere immerso direttamente nella soluzione di stoccaggio. La tabella seguente consiglia le condizioni di conservazione.

 

3 Risultati e analisi

 

3.1 Studio dei fattori che influenzano l'efficienza di rimozione dei pirogeni

Pressione operativa di ultrafiltrazione: 15 lotti di prova sono stati eseguiti in continuo. In ciascun lotto, la pressione di filtrazione è stata mantenuta a 5, 10, 15 e 2{{10}}psi durante l'ultrafiltrazione e il liquido di raccolta del virus è stato concentrato 30 volte ed eluito con liquido tampone (10 volte il volume) in flusso continuo. Risultati, come mostrato nella tabella seguente, il tasso di rimozione dell'endotossina era inferiore all'87,0%, il tasso di recupero dell'antigene era stabile al 86,0% e il tasso di rimozione della proteina ospite era stabile al 90,0%, indicando che le diverse pressioni operative hanno avuto poca influenza sull'effetto del recupero dell'antigene, della rimozione dell'endotossina e della rimozione della proteina ospite.

Rapporto di concentrazione di ultrafiltrazione: 15 lotti di prova sono stati eseguiti in continuo. In ciascun lotto, il liquido raccolto dal virus è stato concentrato rispettivamente 30 volte, 50 volte, 80 volte e 100 volte durante l'ultrafiltrazione. La pressione di filtrazione è stata mantenuta a 20 psi e il liquido tampone (10 volte il volume) è stato eluito a flusso continuo. Risultati, come mostrato nella tabella seguente, il tasso di rimozione dell'endotossina variava dal 53,3% al 86,9%, il tasso di recupero dell'antigene è rimasto stabile al 86,0% e il tasso di rimozione della proteina ospite è rimasto stabile al 91,0%. Nel campionamento segmentato non è stato rilevato alcun antigene nella soluzione di trasmissione e meno del 10% della proteina ospite è rimasta nella soluzione concentrata del virus. La concentrazione di endotossina nella soluzione concentrata del virus aumentava con l'aumento dei tempi di concentrazione, e il tasso di rimozione dell'endotossina era il più alto nel campione concentrato di 80 volte, e il produttore poteva anche considerare la concentrazione di 100 volte, che non solo ha migliorato l’efficienza produttiva e ridotto i costi, ma ha anche soddisfatto i requisiti della produzione di vaccini.

 

3.2 Esaurimento del flusso della cassetta della membrana e rigenerazione della pulizia

Dopo il trattamento, il tasso di recupero del flusso di membrana è stato del 92,6%. Il primo tasso di recupero della nuova cassetta della membrana è normale, secondo le attuali proprietà di osservazione del liquido di alimentazione, la successiva previsione del secondo e dell'NTH tempo, il tasso di recupero del flusso della cassetta della membrana sarà vicino ai dati dopo questo trattamento e tendono ad essere stabili. Entro 2 ore dall’uso singolo, l’esaurimento della cassetta della membrana era ideale e solo il 10% del flusso della membrana era esaurito durante il funzionamento complessivo.

3.2.1 Deplezione di flusso nel processo di trattamento della cassetta con membrana

3.2.2 Risultato della pulizia e rigenerazione della cassetta della membrana

 

Informazioni sulla guida

 

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