Analisi completa del processo di produzione dei farmaci MRNA: come la tecnologia TFF risolve le sfide di purificazione
Negli ultimi anni, la tecnologia dell’mRNA ha compiuto progressi rivoluzionari nel campo biofarmaceutico, dimostrando un enorme potenziale applicativo, in particolare nei vaccini e nella terapia genica. Il successo dello sviluppo dei vaccini a mRNA non solo ha fornito nuove soluzioni per la prevenzione e il controllo delle malattie infettive, ma ha anche favorito progressi nell’immunoterapia antitumorale e nella medicina personalizzata. Trattandosi di una nuova classe di prodotti terapeutici, la produzione di mRNA su larga-scala è estremamente impegnativa, poiché implica il controllo della stabilità dell'RNA, la rimozione degli enzimi residui e dei prodotti di reazione,-lo scambio di tamponi e il raggiungimento di tassi di recupero di elevata-purezza, che richiedono tecnologie di produzione con soluzioni-approvate dalle normative.
Il processo di produzione di vaccini o agenti terapeutici a base di mRNA è principalmente suddiviso in tre fasi: preparazione della soluzione in massa di DNA plasmidico, preparazione della soluzione in massa di mRNA e preparazione del prodotto farmaceutico mRNA-LNP.
Diagramma di flusso del processo di produzione di farmaci mRNA
La filtrazione a flusso tangenziale (TFF), in quanto tecnologia di separazione a membrana ben-affermata, è ampiamente applicata nella produzione di mRNA grazie alla sua capacità di setacciatura molecolare ad alta-efficienza, allo scambio di buffer controllabile e alle caratteristiche di basso stress di taglio. Basate sulla progettazione del modulo a membrana, le configurazioni TFF comuni includono cassette a fogli-piatti e moduli a fibra-cava. Inoltre, la separazione della membrana guidata dalla pressione-nel TFF può essere classificata in microfiltrazione (MF), ultrafiltrazione (UF), nanofiltrazione (NF) e osmosi inversa (RO) in base alla dimensione dei pori della membrana, con selettività progressivamente crescente.
Il TFF svolge un ruolo fondamentale in più fasi della produzione di farmaci mRNA, inclusa la preparazione della massa di DNA plasmidico, la produzione di massa di mRNA e la formulazione finale di prodotti farmaceutici mRNA-LNP. Attraverso un'adeguata selezione del tipo di membrana, del cut{1}}molecolare del peso molecolare (MWCO) e del materiale della membrana, il TFF consente la rimozione efficiente dei sottoprodotti della reazione e delle impurità a basso peso molecolare-della reazione, facilitando inoltre lo scambio e la concentrazione del tampone sia prima che dopo l'incapsulamento dell'LNP. Ciò migliora significativamente la purezza dell'RNA, la stabilità e la scalabilità complessiva del processo.
Inoltre, le prestazioni della filtrazione a flusso tangenziale sono influenzate da fattori di configurazione del sistema come il tipo di pompa e il design dei tubi, nonché da parametri chiave del processo tra cui la pressione transmembrana (TMP), lo stress di taglio e il flusso di filtrazione. Questi fattori devono essere attentamente selezionati e ottimizzati in base alle caratteristiche del prodotto target, in particolare per i prodotti sensibili allo stress-come mRNA–LNP, che sono altamente suscettibili alle forze meccaniche esterne durante la lavorazione.
Purificazione del DNA plasmidico
La preparazione della soluzione madre di DNA plasmidico si basa fondamentalmente sul disegno della sequenza del modello di trascrizione. I metodi di preparazione comportano tipicamente l'amplificazione del DNA plasmidico, sebbene sia possibile utilizzare anche l'amplificazione PCR. Prendendo come esempio l'amplificazione del DNA, ingegnerizzataEscherichia coliè comunemente utilizzato per l'amplificazione basata sulla fermentazione-. Il processo di purificazione a valle comprende principalmente la raccolta cellulare, la lisi e la chiarificazione, la concentrazione e lo scambio di tamponi, la filtrazione sterile, la linearizzazione e la purificazione cromatografica. Negli ambienti industriali, per la raccolta delle cellule viene spesso utilizzata la centrifugazione a flusso continuo-, ma genera forze di taglio relativamente elevate. I sistemi a fibra cava, con i loro canali aperti e il basso taglio, sono più adatti per la manipolazione di campioni con alto contenuto di solidi, alta viscosità o sensibilità al taglio, come il DNA plasmidico. Dopo la raccolta, le cellule vengono sottoposte a omogeneizzazione ad alta-pressione, ultrasuoni o lisi alcalina, seguite da chiarificazione preliminare attraverso filtrazione profonda.
Per facilitare la successiva cromatografia, viene spesso impiegata prima la filtrazione a flusso tangenziale (TFF) utilizzando cassette a membrana o colonne a fibra cava con cut-molecolari di 30 kDa, 100 kDa o 300 kDa per la concentrazione e lo scambio del tampone. Ciò riduce il volume del campione rimuovendo contemporaneamente alcune impurità come RNA, proteine della cellula ospite (HCP) e frammenti di DNA della cellula ospite (HCD). La cromatografia funge da fase di purificazione del nucleo. Tipicamente, la cromatografia a scambio anionico (AEX) è combinata con la cromatografia ad interazione idrofobica (HIC) per rimuovere in modo efficiente le impurità e arricchire il DNA plasmidico superavvolto altamente bioattivo, migliorando così significativamente la purezza del plasmide.
Dopo la purificazione, il plasmide viene nuovamente sottoposto a TFF per concentrare la soluzione alla concentrazione target (solitamente 0,5–2 mg/mL) ed eseguire la dialisi con il tampone di conservazione finale. Questa fase rimuove i sali residui e i solventi organici dal processo, garantendo che il sistema tampone soddisfi i requisiti per le reazioni di trascrizione in vitro (IVT) a valle.
Purificazione dell'mRNA trascritto in vitro (IVT).
La trascrizione in vitro (IVT) e la modifica sono i processi chiave per la preparazione delle soluzioni madre di mRNA. Durante la produzione dell'mRNA dell'IVT, viene impiegata una combinazione di filtrazione a flusso tangenziale (TFF1) – cromatografia – filtrazione a flusso tangenziale (TFF2). Questa strategia garantisce una purificazione efficiente e di alta-qualità dell'mRNA, fornendo un supporto fondamentale per la produzione di vaccini.
Una volta completate le reazioni di trascrizione e modificazione, in genere viene eseguita per prima l'ultrafiltrazione/diafiltrazione utilizzando cassette a membrana o colonne a fibra cava con cut-molecolari limite di 30 kDa, 100 kDa o 300 kDa. Questo passaggio rimuove efficacemente varie impurità-correlate al processo dal sistema di reazione, come RNA polimerasi, frammenti residui di DNA, NTP non reagiti, enzimi di copertura, RNA a doppio filamento (dsRNA) e inibitori di piccole{7}molecole, ottenendo contemporaneamente lo scambio di buffer. Dopo una singola fase di filtrazione a flusso tangenziale, la maggior parte delle impurità vengono effettivamente rimosse e l'unica impurità proteica residua rilevabile è la RNA polimerasi.
Successivamente, vengono applicate più tecniche cromatografiche per un'ulteriore purificazione. I metodi comunemente utilizzati includono la cromatografia di affinità, la cromatografia ad esclusione dimensionale, la cromatografia a fase inversa a coppia ionica-e la cromatografia a scambio ionico-. Attraverso questa combinazione di ultrafiltrazione e cromatografia sequenziale, l'mRNA raggiunge un elevato livello di purezza.
Per soddisfare i requisiti di formulazione o conservazione, la soluzione madre di mRNA viene nuovamente concentrata o diluita utilizzando cassette a membrana da 30 kDa, 100 kDa o 300 kDa o colonne a fibra cava per regolare con precisione la concentrazione target e scambiarla nel tampone di formulazione finale. Infine, viene applicata una filtrazione di grado sterile- per controllare la carica microbica, completando lo stoccaggio temporaneo e il riempimento del materiale.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Purificazione di formulazioni di mRNA-LNP
Le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono attualmente il sistema di rilascio più ampiamente studiato per le terapie a base di mRNA. Attualmente, varie formulazioni di mRNA-LNP si trovano in diverse fasi di sviluppo preclinico e clinico. Gli LNP sono altamente sensibili ai processi di produzione. Tra le operazioni unitarie richieste per la produzione di mRNA-LNP, la concentrazione e lo scambio di buffer tramite filtrazione a flusso tangenziale (TFF) e la filtrazione sterile presentano sfide significative. Questi passaggi devono essere attentamente ottimizzati per garantire la scalabilità del processo e la qualità del prodotto, evitando problemi quali incrostazione della membrana e caricamento errato del filtro.
Dopo l'incapsulamento dell'mRNA, per la purificazione viene utilizzata la filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Lo scopo di questa fase è rimuovere l'mRNA non incapsulato, i polimeri liberi o i materiali lipidici, nonché i solventi residui dall'mRNA e dai lipidi. Poiché gli LNP mRNA- mostrano una stabilità limitata a temperatura ambiente, l'ottimizzazione dei processi a valle, incluso il TFF, è fondamentale per mantenere la qualità del prodotto.
Le principali direzioni di ottimizzazione includono: impostare adeguatamente la pressione transmembrana (TMP) e la portata tangenziale in base alle dimensioni delle particelle e alla stabilità degli mRNA-LNP per bilanciare l'efficienza di filtrazione e lo stress delle particelle; selezionare membrane o colonne a fibra cava con adeguati cut-peso molecolare (MWCO, ad esempio, 100 kDa o 300 kDa) per rimuovere in modo efficiente mRNA libero, impurità e tampone di scambio riducendo al minimo l'adsorbimento o il danno delle particelle; e ottimizzare i volumi di concentrazione e diafiltrazione per garantire un efficace scambio di tampone nella formulazione target e controllare la concentrazione e la dispersione delle particelle finali.
Inoltre, gli attributi critici di qualità (come la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersità [PDI] e l'efficienza di incapsulamento dell'mRNA) devono essere attentamente monitorati durante il processo e i parametri regolati dinamicamente in base a dati in tempo reale- per ottenere una purificazione e formulazione stabile, scalabile ed efficiente degli mRNA-LNP.
Inoltre, a causa dell'instabilità degli mRNA-LNP e dei loro componenti nei metodi di sterilizzazione terminale, viene generalmente utilizzato un filtro sterile da 0,2 µm-per rimuovere batteri e altri contaminanti microbici.