Processo di purificazione a valle su scala industriale-per il vaccino contro la rinotracheite infettiva bovina (IBR) - Sezione "Ultrafiltrazione"

La rinotracheite infettiva bovina (IBR) è causata dall'infezione da parte del virus della rinotracheite infettiva bovina (IBRV), noto anche come herpesvirus bovino di tipo 1 (BHV-1). La malattia è caratterizzata principalmente da sintomi respiratori e aborto. Oltre a queste manifestazioni cliniche, l’IBR può portare a una ridotta produzione di latte nei bovini da latte e a un ridotto aumento di peso nei bovini da carne, con conseguenti perdite economiche significative per gli allevamenti.

La malattia è di natura immunosoppressiva. Quando si presenta come una singola infezione, la sua patogenicità è relativamente bassa; tuttavia, quando si verificano infezioni miste con altre malattie virali o batteriche, la gravità e i danni aumentano in modo significativo. La vaccinazione è il metodo più efficace per la prevenzione e il controllo, con due principali tipi di vaccini disponibili: vaccini vivi attenuati e vaccini inattivati. Attualmente i vaccini per la rinotracheite infettiva bovina utilizzati negli allevamenti sono prevalentemente vaccini inattivati.

I vaccini vivi attenuati sono caratterizzati da forte immunogenicità, rapida insorgenza dell’immunità e lunga durata della protezione (solitamente più di sei mesi). Sono comunemente usati per l’immunizzazione di emergenza durante le epidemie. Tuttavia, comportano rischi potenziali di diffusione del virus, comportano rischi per le mucche gravide e non possono essere utilizzati in bovini con infezione latente ma asintomatici.

I vaccini inattivati ​​sono caratterizzati da un’elevata sicurezza, senza rischio di diffusione del virus o di ritorno alla virulenza, e sono considerati assolutamente sicuri. Possono essere utilizzati nei bovini in tutte le fasi, comprese mucche gravide, vitelli e tori da riproduzione. Tuttavia, l’insorgenza dell’immunità è relativamente lenta e la durata della protezione è più breve, quindi di solito sono necessarie vaccinazioni di richiamo. In alcuni casi, l’efficacia protettiva può essere inferiore a quella dei vaccini vivi attenuati.

Indipendentemente dal fatto che venga utilizzato un vaccino vivo attenuato o un vaccino inattivato, il processo di purificazione a valle può essere suddiviso in quattro fasi principali: raccolta e chiarificazione → concentrazione e purificazione primaria → purificazione di lucidatura → inattivazione/filtrazione sterile e formulazione.

La concentrazione è una fase fondamentale nel processo di purificazione a valle dei vaccini, immediatamente dopo la chiarificazione. Il suo obiettivo principale è quello di ridurre rapidamente la soluzione chiarificata del virus raccolta in grandi-volumi e a bassa-concentrazione in una forma di-volume piccolo e ad alta-concentrazione, mantenendo la bioattività virale. Ciò crea le condizioni necessarie per le successive fasi di purificazione fine ad alta-risoluzione ma a bassa-capacità, come la cromatografia.

Questa fase viene generalmente eseguita utilizzando l'ultrafiltrazione a flusso tangenziale (TFF). Il principio è il seguente: la soluzione di alimentazione virale scorre parallelamente alla superficie di una membrana di ultrafiltrazione con una dimensione dei pori specifica. Sotto pressione, piccole molecole come acqua, sali e alcune impurità passano perpendicolarmente attraverso la membrana e vengono rimosse, mentre le particelle virali intatte, che sono molto più grandi dei pori della membrana, vengono trattenute, ricircolate continuamente e concentrate. Rispetto alla tradizionale centrifugazione ad alta-velocità, questo metodo è più delicato per i virus fragili come l'IBRV, che hanno un involucro lipidico. Riduce efficacemente il danno strutturale del virus e la perdita di attività causata da forze di taglio elevate ed è più suscettibile di scalabilità lineare-per la produzione industriale.

Un'operazione di concentrazione riuscita è molto più che una semplice riduzione del volume. I punti chiave per l'ottimizzazione del processo includono: controllo preciso della pressione transmembrana e della portata di alimentazione per bilanciare l'efficienza di filtrazione riducendo al minimo la polarizzazione della concentrazione e l'incrostazione della membrana; selezionare il materiale della membrana e la dimensione dei pori appropriati per garantire un'elevata ritenzione del virus e un flusso di permeato elevato; e trovare l'equilibrio ottimale tra recupero del virus, fattore di concentrazione e tempo di elaborazione. La sospensione virale concentrata non solo raggiunge un titolo significativamente più elevato, ma ottiene anche una purificazione preliminare rimuovendo gran parte delle impurità solubili in acqua. Ciò fornisce il volume e la concentrazione necessari per le successive fasi critiche di raffinazione, come la cromatografia e il trattamento con nucleasi, rendendo la concentrazione un hub di efficienza centrale nell'intero processo a valle.

La diafiltrazione secondaria è una fase critica nella purificazione a valle del vaccino, posizionata dopo la purificazione fine e prima della formulazione. Viene tipicamente effettuato dopo la cromatografia e il trattamento con nucleasi. Il suo scopo principale non è la concentrazione iniziale, ma lo scambio di sistema e la regolazione precisa delle condizioni della formulazione finale. Il processo viene eseguito in un sistema di ultrafiltrazione a flusso tangenziale (TFF), in cui il tampone di formulazione fresco e pulito viene aggiunto continuamente alla soluzione virale concentrata circolante, mentre il solvente originale e le impurità delle piccole-molecole vengono rimossi. Questa operazione elimina in modo efficace e delicato i sali residui, i solventi organici, i prodotti di degradazione delle nucleasi e le tracce di impurità solubili rimanenti dal processo di purificazione.

La chiave è mantenere un volume costante o applicare piccoli aggiustamenti della concentrazione per garantire che la concentrazione del virus soddisfi le specifiche della formulazione. Per i virus fragili e avvolti come il virus della rinotracheite infettiva bovina (IBRV), il delicato ambiente idrodinamico della diafiltrazione secondaria è fondamentale per preservare l'integrità e l'immunogenicità delle particelle. In definitiva, questa fase fornisce una solida base per la successiva inattivazione (se richiesta), l'aggiunta di adiuvanti o stabilizzanti e il riempimento finale, garantendo che il prodotto finale entri nella formulazione con componenti definiti, condizioni uniformi e buona compatibilità. Si tratta quindi di uno dei passaggi fondamentali per garantire la sicurezza, la stabilità e la coerenza dei vaccini tra-lotti-lotti.

L'IBRV è un virus a DNA lineare con involucro, a doppio- filamento, con un involucro approssimativamente sferico. Le particelle IBRV mature hanno un diametro di circa 160–230 nm. Di conseguenza, l'utilizzo di membrane di ultrafiltrazione da 100, 300 o 500 kDa può trattenere l'IBRV rimuovendo alcune proteine ​​contaminanti. Il tasso di recupero dell'ultrafiltrazione delle cassette a membrana Jiuling Technology varia a seconda del tipo di materiale di alimentazione, ma generalmente raggiunge il 90–95%.