Studio sul processo di chiarificazione del lisato di fermentazione ad alta densità di Escherichia Coli ricombinante

 

Per ridurre l'interferenza del fluido materiale sulla cromatografia e migliorare il recupero della proteina target, è stato studiato il processo di chiarificazione del lisato di fermentazione ad alta densità di due ceppi di Escherichia coli ricombinante. Sono stati selezionati i ceppi BL21-HP1036 e BL21-palA che esprimono geni chiave di Streptococcus suis e Haemophilus parasuis. Sono stati utilizzati il ​​processo di flusso tangenziale, il processo di centrifugazione ad alta velocità e il processo di chiarificazione della cassetta a membrana per valutare la resa proteica mediante rilevamento di torbidità ed elettroforesi.

 

I risultati hanno mostrato che il lisato di fermentazione ad alta densità BL21-HP1036, BL21-palA che esprime geni chiave di Streptococcus suis e Haemophilus parasuis è stato chiarito mediante filtrazione su cassetta a membrana e centrifugazione, e la resa proteica è stata superiore all'80%, il che potrebbe ridurre efficacemente l'interferenza cromatografica e migliorare il tasso di recupero.

 

Introduzione

Attualmente, Streptococcus suis (SS) e Haemophilus parasuis (HPS) sono i patogeni batterici più comuni negli allevamenti di suini, che causano grandi perdite all'industria suinicola. SS può essere suddiviso in un totale di 35 sierotipi 1-34 e 1/2, e HPS può essere suddiviso in 1-15 sierotipi, e i due sono spesso mescolati, causando principalmente polisierosite suina, artrite, meningite, endocardite, setticemia batterica e bronchite.

 

A causa dell'elevato numero di sierotipi di Streptococcus suis e Haemophilus parasuis, la protezione crociata tra diversi sierotipi è debole e la resistenza agli antibiotici aumenta significativamente quando si cura con antibiotici, il che ne influenza l'effetto terapeutico.

 

I vaccini sono diventati uno dei mezzi efficaci per prevenire SS e HPS. Esistono vaccini inattivati, vaccini attenuati, vaccini vivi, vaccini subunitari e vaccini geneticamente modificati, ma i vaccini inattivati ​​e attenuati sono principalmente sul mercato e la loro protezione immunitaria è buona, ma la protezione crociata non è ovvia. Il vaccino subunitario è un nuovo tipo di vaccino contro lo streptococcus suis, che è un nuovo tipo di vaccino con forte protezione crociata e basso prezzo. La ricerca e lo sviluppo di vaccini subunitari di Streptococcus suis e Haemophilus parasuis fornisce una soluzione perfetta ai problemi di prevenzione e controllo di Streptococcus suis e Haemophilus parasuis che affliggono l'industria suinicola in Cina.

 

I vaccini a subunità Streptococcus suis e Haemophilus parasuis sono sottoposti a fermentazione ad alta densità da parte di Escherichia coli ricombinante. La chiarificazione del lisato ha un grande effetto sulla resa delle proteine ​​target, ma ci sono pochi report pertinenti. Come realizzare la fase di chiarificazione del processo di fermentazione e purificazione è un lavoro importante. In questo documento, la fermentazione ad alta densità di E. coli ricombinante BL21-HP1036, BL21-palA come oggetto, per studiare come ridurre in modo efficiente la torbidità della soluzione chiarificante, migliorare la resa proteica, per il processo di fermentazione del vaccino a subunità Streptococcus suis per ottenere una tecnologia di frantumazione e chiarificazione industriale per fornire basi teoriche e supporto tecnico.

 

1. Materiali e metodi

1.1 Materiali

 

1.1.1 Ceppi

Ceppi di Streptococcus suis e Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Mezzi principali e reagenti

Estratto di lievito e focena; Cloruro di sodio; Kanamicina, IPTG; Formaldeide da; Kit gel SDS-PAGE.

 

1.1.3 Principali apparecchiature di prova

Fermentatore ad alta densità; Centrifuga ad alta velocità; Apparecchiatura per elettroforesi; Sistema di imaging su gel ultravioletto; Frantoio a ultrasuoni; Piccola centrifuga ad alta velocità; Spettrofotometro ultravioletto; Tavolo vibrante a temperatura costante; Attrezzatura per cromatografia di affinità.

 

1.2 Metodi

 

1.2.1 Coltura di fermentazione ad alta densità

I ceppi coliformi ricombinanti qualificati BL21-HP1036 e BL21-pa-lA sono stati inoculati su un terreno sintetico al 2% (V/V) e coltivati ​​a 37 gradi per 35-40 ore.

 

1.2.2 Espressione indotta da proteine ​​ricombinanti

Quando la soluzione di fermentazione OD{{0}}±0.1, è iniziata l'induzione, la temperatura di induzione era di 35 gradi ±0,5 gradi e la coltura è terminata dopo 10 ore di induzione.

 

1.2.3 Frantumazione omogenea ad alta pressione e centrifugazione

Il liquido batterico che ha superato il test di inattivazione è stato frantumato da un omogeneizzatore ad alta pressione per la rottura delle cellule, rispettivamente, con una pressione di 100~150 MPa. Dopo la frantumazione, il liquido frantumato è stato mantenuto a bassa temperatura.

Il surnatante è stato ottenuto mediante centrifugazione ad alta velocità, velocità di centrifugazione: 15 300 giri/min, controllo della temperatura: 10 gradi ~ 15 gradi, velocità di iniezione: 0,5 ~ 1 L/min, rispettivamente, il surnatante è stato raccolto e riempito con contenitori che hanno rimosso l'endotossina.

 

1.2.4 Chiarificazione a cassetta con membrana di microfiltrazione

La membrana è stata lavata con 10L di acqua purificata in una direzione ed è stata eseguita una filtrazione a flusso tangenziale. 300 mL della sospensione batterica rotta dopo la centrifugazione sono stati prelevati dalla centrifuga della conduttura e chiarificati con una cassetta a membrana per microfiltrazione da 0,45 µm. La torbidità è stata misurata rispettivamente tramite campionamento e sono state confrontate la torbidità dopo la centrifugazione, la torbidità del liquido chiarificato nella cassetta a membrana per microfiltrazione e la torbidità del liquido concentrato nella cassetta a membrana per microfiltrazione. Il contenuto proteico del campione è stato rilevato tramite cromatografia ed elettroforesi per valutare la resa proteica.

 

Fase 2: Risultati

2.1 Dati di chiarimento e risultati dei test sulla proteina BL21-HP1036 e BL21-palA

I risultati in FIG. 1 mostrano che la torbidità del fluido di frantumazione di Escherichia coli ricombinante BL21-HP1036 e BL21-palA è diminuita da 4 500 NTU e 4 000 NTU a 1970 NTU e 520 NTU, rispettivamente, dopo la centrifugazione in provetta. La torbidità di Escherichia coli ricombinante BL21-HP1036 e BL21-palA è stata ridotta a 25 NTU e 1,28 NTU con il metodo della cassetta a membrana di microfiltrazione. Si può vedere che l'uso della filtrazione a flusso tangenziale della cassetta a membrana di microfiltrazione e del canale a flusso aperto ottimizzato ha un buon effetto sulla riduzione di endotossina, viscosità e torbidità del liquido cromatografico rispetto alla tradizionale filtrazione centrifuga e può ridurre significativamente l'eteroproteina e l'acido nucleico di E. coli ricombinante rotto.

 

2.2 Recupero proteico dei campioni BL21-HP1036 e BL21-palA

La Tabella 1 mostra che la proteina ricombinante Escherichia coli BL21-HP1036 esiste sia nella soluzione chiarificata tramite microfiltrazione che nel supernatante concentrato coperto dalla membrana di microfiltrazione e la resa proteica totale dopo il recupero della proteina dalla soluzione chiarificata tramite microfiltrazione e dal supernatante concentrato è di circa l'88,5%. La proteina BL21-palA esisteva anche nella soluzione chiarificata dell'essudato di microfiltrazione e nel supernatante della soluzione concentrata coperto dalla cassetta della membrana di microfiltrazione. La resa totale della proteina BL21-PALa era dell'81,5%.

 

3. Conclusione

In questo articolo, i ceppi che esprimono i geni chiave BL{{0}}HP1036 e BL21-palA rispettivamente di Streptococcus suis e Haemophilus parasuis sono stati sottoposti a fermentazione ad alta densità e hanno superato 0,45 La torbidità del materiale liquido è stata significativamente ridotta dal processo di cassetta a membrana di microfiltrazione um, indicando che la tecnologia di filtrazione a flusso tangenziale con cassetta a membrana di microfiltrazione era migliore di quella con centrifuga ad alta velocità e poteva ridurre significativamente le impurità proteiche e l'acido nucleico dell'Escherichia coli ricombinante rotto.

 

Dopo aver raccolto il liquido limpido nella cassetta a membrana di microfiltrazione singola, c'era il 62,9% Poiché il 37,1% della proteina target di BL21-HP1036 era concentrato di microfiltrazione o era presente nella cassetta a membrana di microfiltrazione e altre perdite, è stato adottato un metodo in due fasi per la chiarificazione. Nella prima fase, è stata utilizzata una cassetta a membrana di microfiltrazione da 0,45 um per chiarire e raccogliere l'essudato; nella seconda fase, il liquido concentrato rimanente è stato raccolto dopo la centrifugazione in provetta e il liquido chiarificato in due fasi è stato combinato come campione cromatografico Il valore di torbidità del liquido di fermentazione BL21-palA non è aumentato in modo significativo, la resa proteica potrebbe raggiungere oltre l'85,5% e la resa proteica del liquido di fermentazione BL21-Pala potrebbe raggiungere l'81,5% dopo il trattamento in due fasi.

 

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