Studio sull'applicazione della filtrazione profonda nel processo di produzione del vaccino contro l'afta epizootica

Prefazione - Cos'è l'afta epizootica

Nel XIV secolo esistono testimonianze scritte di afta epizootica simili in Europa. L'afta epizootica è una malattia acuta, febbrile e altamente contagiosa causata dal virus dell'afta epizootica.

I sintomi clinici degli animali adulti includono: aumento della temperatura corporea, vescicole e ulcerazioni nella bocca, vesciche e ulcerazioni nello zoccolo e persino perdita di guscio, con difficoltà a mangiare e a dormire, perdita di peso e persino perdita di valore economico negli animali economici. ;

I sintomi clinici degli animali giovani comprendono: temperatura corporea elevata, miocardite e altri sintomi, una volta insorti, gli animali giovani hanno un'elevata mortalità.

 

Astratto

Negli ultimi 500 anni, l’afta epizootica si è diffusa ripetutamente in tutto il mondo e un gran numero di suini, bovini, ovini e altri animali domestici e ungulati selvatici sono morti o si sono ammalati, colpendo gravemente il bestiame e l'industria dell'allevamento.

 

Al fine di studiare l'applicazione della tecnologia di filtrazione profonda nel processo di produzione del vaccino contro l'afta epizootica, sono state testate e confrontate le prestazioni di filtrabilità della filtrazione superficiale e della filtrazione profonda, nonché l'effetto protettivo sulla filtrazione battericida. Sono stati studiati i vantaggi della filtrazione profonda ad alta carica nella rimozione dei detriti cellulari. Sono stati analizzati i corrispondenti schemi di filtrazione per terreni di coltura cellulare con diversa torbidità.

 

I risultati hanno mostrato che il carico di filtrazione profonda era 13,9 volte quello della filtrazione superficiale, la torbidità del liquido filtrante era solo il 23,5% della filtrazione superficiale e il successivo carico di debatterializzazione di 0.2um era 7,2 volte quello della filtrazione superficiale. filtrazione superficiale. Utilizzando la sua speciale resina legante, la torbidità del liquido filtrante è pari al 38,6% di quella del normale filtro profondo con la stessa dimensione dei pori, il che è vantaggioso per proteggere il processo a valle. I risultati hanno mostrato che la filtrazione profonda, in particolare la filtrazione profonda a carica positiva elevata, potrebbe essere applicata efficacemente alla produzione del vaccino contro l’afta epizootica e che dovrebbero essere stabiliti processi di filtrazione adeguati per diversi terreni di coltura.

 

Afta epizootica e filtrazione profonda

L'afta epizootica (FMD) è una malattia acuta, febbrile e contagiosa degli ungulati causata dal virus dell'afta epizootica (FMDV). Gli animali più suscettibili a questa malattia sono bovini, suini e ovini. L'afta epizootica è endemica in Asia, Africa, Medio Oriente e America del Sud, con un'incidenza molto elevata e una trasmissione rapida. L'Organizzazione mondiale per la salute animale (OIE) la elenca come la malattia zoonotica di prima categoria A, imponendo agli Stati membri di includere l'afta epizootica nell'elenco delle malattie animali soggette a notifica. La vaccinazione è un mezzo efficace di prevenzione specifica dell'afta epizootica. Il vaccino inattivato dell'afta epizootica, ottenuto inattivando il virus intatto con un inattivatore, svolge un ruolo importante nella prevenzione e nel controllo dell'afta epizootica.

L'antigenicità dell'afta epizootica stessa è scarsa e l'inattivazione del virus ha un grande impatto sul suo antigene. Pertanto, nell'attuale produzione di vaccino contro l'afta epizootica, il vaccino contro l'afta epizootica ad elevata purezza può garantire il contenuto antigenico e la purezza della dose unitaria, il che è particolarmente importante ed è anche l'attuale strategia di vaccinazione. Ciò pone requisiti elevati per la purificazione a valle dei virus. Inoltre, prima del 2009, in Cina i vaccini inattivati ​​contro l’afta epizootica adottavano per lo più il metodo di coltura che prevedeva la rotazione della bottiglia e l’adesione al muro. Con la crescente domanda di vaccini, sono gradualmente emersi gli svantaggi di questo metodo di coltura che richiede un gran numero di flaconi rotanti, una bassa efficienza e un basso livello di espressione.

Pertanto, negli ultimi anni, la tecnologia delle colture cellulari è cambiata lentamente dalla precedente coltura aderente alla coltura in sospensione e la produzione del virus è stata notevolmente migliorata. Tuttavia, con l’aumento della produzione di virus, il cambiamento della modalità di coltura ha esercitato una maggiore pressione sulla purificazione a valle, poiché sono aumentati di conseguenza i detriti cellulari generati dal processo di coltura, il rilascio cellulare di proteine ​​ospiti, DNA ospite, ecc., il che impone ulteriori requisiti alla capacità di depurazione a valle.

La tecnologia di filtrazione a membrana è ampiamente utilizzata nel processo di produzione di prodotti biologici come i vaccini, tra cui la tecnologia di filtrazione DC viene solitamente utilizzata nel processo di raccolta del veleno della malattia per separare le impurità insolubili come i detriti cellulari. Nei primi chiarimenti della FMDV, è stata adottata principalmente la tecnologia di filtrazione superficiale rappresentata dall'elemento filtrante a membrana pieghevole. Con il cambiamento delle condizioni di coltura, l'aumento delle impurità dei detriti cellulari, la filtrazione superficiale è difficile da ottenere l'effetto di chiarificazione e poiché il carico di filtrazione superficiale è basso, il costo dei materiali filtranti diventa sempre più alto.

 

In questo contesto, la filtrazione profonda è stata applicata sempre più spesso nel processo di separazione citoliquida dell'afta epizootica. Il materiale del filtro profondo è solitamente composto da fibre lunghe e fini provenienti da fonti naturali e il canale formato dal mezzo filtrante dopo aver formato una pellicola è spesso molto tortuoso, simile alla struttura dell'apertura a labirinto. Le particelle di impurità sono spesso intrappolate all'interno del filtro anziché sulla superficie. Inoltre, la parete del canale del filtro spesso assorbe una parte di impurità di particelle estremamente fini mediante azione elettrostatica o forza intermolecolare. In generale, il meccanismo di filtrazione della filtrazione profonda è caratterizzato da ritenzione meccanica e adsorbimento.

 

Metodo di filtraggio a corrente costante

Installare la piastra del filtro profondo sul dispositivo di filtraggio a corrente costante, lavare la piastra del filtro con tampone PBS superiore a 54 L/m2; Al termine del lavaggio, avviare la pompa peristaltica per pompare lentamente il liquido, regolare lentamente la velocità della pompa circa alla portata prevista e filtrare il liquido. Registrare il volume di filtrazione, il tempo, la differenza di pressione e la torbidità durante il processo di filtrazione. Il filtrato è stato raccolto per il rilevamento dell'antigene.

 

Vantaggi della filtrazione profonda

La filtrazione superficiale è una tecnologia che cattura le particelle sulla superficie del materiale filtrante per ottenere la filtrazione. Il meccanismo di filtrazione si basa principalmente sulla dimensione delle particelle nel setaccio del fluido, le particelle più grandi vengono intrappolate sulla superficie della membrana del filtro. La filtrazione profonda utilizza canali interni per l'intercettazione e l'adsorbimento delle particelle in profondità. Il diagramma di confronto dei due è mostrato nella Figura 1.

La soluzione inattivata del vaccino contro l'afta epizootica di un determinato produttore è stata prefiltrata rispettivamente mediante membrana superficiale in polipropilene da 0.45um e piastra filtrante profonda, e quindi filtrata mediante filtro battericida da 0.2um. I dati sulla filtrabilità sono mostrati nella Tabella 1.

 

La torbidità della soluzione inattivata del vaccino contro l'afta epizootica è di 77 NTU. Se i batteri vengono filtrati direttamente, un gran numero di frammenti cellulari causerà inevitabilmente il rapido blocco della membrana del filtro 0.2um, il che influenzerà la trasmissione delle particelle vi 146S. Pertanto, la prefiltrazione è stata progettata prima della filtrazione di debatterializzazione e sono stati confrontati i due metodi di prefiltrazione di filtrazione profonda e filtrazione superficiale. La piastra del filtro profondo a doppio strato è selezionata per la filtrazione, il carico è di 641 L/m2 e il filtro profondo riduce il materiale da 77 NTU a 9,65 NTU, che è chiaro e luminoso. Il carico di filtrazione superficiale di 0.45um è di soli 46 L/m2 e la torbidità del liquido filtrante arriva fino a 41 NTU, il che non è adatto per la prefiltrazione. Secondo il confronto del successivo carico di filtrazione debatterizzata pari a 0.2um, il carico della membrana di filtrazione debatterizzata dopo la filtrazione profonda è di 655 L/m2, ovvero 7,2 volte il corrispondente carico di filtrazione della filtrazione superficiale (solo 91 L/m2) .

I risultati dei test 146S mostrano che la resa del sistema di filtrazione profonda è superiore a quella del sistema di filtrazione superficiale. Il carico di filtrazione profonda era 13,9 volte quello della filtrazione superficiale, la torbidità del liquido filtrante era solo il 23,5% di quella della filtrazione superficiale e il successivo carico di filtrazione per la rimozione dei batteri di 0.2um era 7,2 volte quello del filtraggio superficiale. filtrazione superficiale. Pertanto, sia dal punto di vista dei costi che dal punto di vista della resa, il sistema di filtrazione profonda è nettamente migliore rispetto al sistema di filtrazione a membrana superficiale.

 

Vantaggi del filtro profondo a forte carica positiva

La piastra del filtro profondo a carica positiva e la piastra del filtro profondo a carica positiva elevata sono state utilizzate per confrontare la soluzione inattivata di vaccino contro l'afta epizootica proveniente da diverse fonti. I risultati della filtrabilità sono mostrati nella Tabella 2 e la variazione della velocità di filtrazione e della differenza di pressione nel processo di filtrazione è mostrata nella disposizione dei colori 2.

I due gruppi di piastre filtranti profonde utilizzate hanno la stessa precisione di apertura e le prestazioni sono molto coerenti dal punto di vista del carico e della variazione della differenza di pressione e la curva di variazione della differenza di pressione nella Figura 2 è sostanzialmente identica.

 

Tuttavia, dalla torbidità del liquido filtrante, la differenza è molto grande. Il liquido filtrante della normale piastra filtrante a doppio strato caricata positivamente è di 25 NTU, mentre il liquido filtrante della piastra filtrante a strato profondo fortemente caricata positivamente con la stessa apertura è di soli 9,65 NTU, ovvero solo il 38,6% della normale piastra filtrante profonda. Ciò è dovuto principalmente allo speciale legante in resina nel materiale filtrante della piastra filtrante profonda con forte carica positiva. La torbidità viene ridotta a meno di 10 NTU dalla piastra filtrante a doppio strato fortemente positiva e i frammenti cellulari vengono completamente assorbiti o intrappolati, il che favorisce il successivo processo di ultrafiltrazione o filtrazione battericida. Oltre all'effetto di adsorbimento sui detriti cellulari insolubili, Yigzaw Y et al hanno anche riportato l'effetto di rimozione della piastra filtrante profonda fortemente caricata positivamente sulla proteina ospite della cellula, e Dorsey N et al hanno riportato l'effetto di rimozione della piastra filtrante profonda fortemente caricata positivamente sul DNA.

 

Messa a punto del processo di filtrazione e chiarificazione del surnatante del vaccino contro l'afta epizootica mediante filtrazione profonda

Attraverso lo studio comparativo di cui sopra sulla filtrazione superficiale e sulla filtrazione profonda e lo studio dell'effetto di chiarificazione della speciale piastra filtrante profonda a forte carica positiva, diversi schemi di filtrazione dovrebbero essere abbinati al surnatante inattivato del vaccino contro l'afta epizootica prodotto in diverse condizioni. condizioni culturali. Per il surnatante centrifugo con 3 diverse torbidità, bassa torbidità, media torbidità e alta torbidità, lo schema di filtrazione profonda e i corrispondenti parametri di filtrazione sono mostrati nella Tabella 3.

Per il surnatante centrifugo con bassa torbidità, la piastra filtrante profonda a strato singolo può efficacemente chiarire e rimuovere una piccola quantità di detriti cellulari. Per il surnatante centrifugo di torbidità media, la piastra filtrante profonda a doppio strato può chiarire efficacemente, in particolare la piastra filtrante profonda con forte carica positiva può ridurre la torbidità a meno di 5 NTU; Per il surnatante centrifugo con maggiore torbidità, la piastra filtrante combinata può essere efficacemente chiarificata. Indipendentemente dal processo, la capacità di trattamento è di 500 ~800 L/m2, la torbidità del liquido filtrante è inferiore a 20 NTU e l'antigene target è completamente recuperato, adatto per la produzione su larga scala.

 

Discussione

Negli anni '70, i media filtranti furono specificati per non utilizzare materiali di amianto, a causa della presenza di agenti cancerogeni nei materiali di amianto. Il materiale del filtro profondo non contiene amianto e ha una carica positiva più forte. Il materiale filtrante è costituito da matrice di fibra di legno e coadiuvante filtrante. Nel processo di produzione, la resina polimerica viene utilizzata per collegare i componenti di base e i gruppi funzionali a carica positiva in essa contenuti conferiscono efficacemente la capacità di assorbimento della carica del materiale del filtro profondo. Le eccellenti prestazioni della filtrazione profonda adsorbente sulla capacità di cattura delle particelle fini sono mostrate nella Figura 3.

In questo esperimento sono stati selezionati diversi componenti di resina e diversi materiali di filtraggio profondo di precisione per chiarire il test di filtrazione della soluzione di coltura FMDV e il test di confronto è stato effettuato con filtrazione superficiale. I risultati hanno mostrato che la filtrazione profonda era più adatta per la rimozione dei detriti cellulari rispetto alla filtrazione superficiale, il che era favorevole alla successiva unità di filtrazione per il controllo della carica microbica (0.2um). Inoltre, confrontando l'effetto di filtrazione della piastra del filtro profondo a carica positiva forte e della piastra del filtro profondo a carica positiva ordinaria, la piastra del filtro profondo a carica positiva forte mostra una forte capacità di controllo della torbidità, che può ridurre la torbidità a meno di 5 NTU, che è molto favorevole a migliorare la robustezza dell'intero processo di filtrazione.

Il processo di coltura a monte ha una grande influenza sulle fasi di raccolta dei principi attivi. Attraverso i test, questo esperimento ha finalmente stabilito uno schema di filtrazione scalabile per terreni di coltura cellulare con diversa torbidità, che ha un certo significato guida per la produzione su larga scala.

Il filtro di profondità lanciato da Guidling Technology è un elemento filtrante del tipo a disco, ovvero una sorta di elemento filtrante efficiente con cartone filtrante profondo come materiale filtrante, che soddisfa pienamente i requisiti normativi del settore biofarmaceutico, principalmente progettato e prodotto appositamente per la rimozione di grandi contenuti solidi come cellule e frammenti cellulari e possono essere applicati al fluido di coltura cellulare di mammiferi; Chiarificazione del lisato di batteri e cellule di lievito; Rimozione della proteina della cellula ospite (HCP); Rimuovere virus e DN; Rimozione delle endotossine; La rimozione dell'antischiuma.

Il prodotto presenta i vantaggi di volume morto ridotto, amplificazione lineare, struttura della capsula a disco, design della struttura compatta e può essere utilizzato in serie con altre apparecchiature, ingombro ridotto, portata stabile, lunga durata e basso costo.