Processo di purificazione a valle del vaccino contro la diarrea suina

La diarrea è una delle tre principali malattie che hanno causato grandi perdite economiche all’industria suina in Cina. Ci sono molti fattori che causano la diarrea nei suini e i fattori virali sono i più gravi. Possono essere infettati i suini di tutte le età, soprattutto i suinetti da latte, e il tasso di mortalità dopo l'infezione può raggiungere oltre il 50%. Il virus della diarrea epidemica suina (PEDV) e il virus della gastroenterite trasmissibile suina (TGEV) sono diffusi nel mondo e i due virus possono essere infettati singolarmente o in combinazione. Attualmente non esistono farmaci specifici per il trattamento del PEDV e del TGEV e la prevenzione e il controllo della diarrea suina sono principalmente vaccini commerciali.

I vaccini tradizionali contro la diarrea epidemica suina comprendono principalmente il vaccino inattivato con virus intero e il vaccino vivo attenuato. Clinicamente, sono comunemente usati il ​​vaccino inattivato tandem o il vaccino attenuato PEDV e TGEV e il vaccino triplo inattivato o attenuato PEDV, TGEV e il rotavirus suino (RV), principalmente il vaccino tandem PEDV e TGEV.

Attualmente in Cina esistono numerosi vaccini contro la diarrea epidemica suina.

Il processo di produzione dei vaccini inattivati ​​e attenuati è simile e comprende principalmente cinque fasi di coltura del patogeno, inattivazione o attenuazione del patogeno, estrazione e purificazione del patogeno, preparazione e confezionamento del vaccino e controllo di qualità del vaccino. Questo articolo introduce principalmente la procedura di purificazione degli agenti patogeni.

Chiarimento

Lo scopo della chiarificazione è garantire la rimozione dei detriti cellulari e di altri aggregati di particelle di grandi dimensioni. Nella produzione di colture cellulari di vari veleni, oltre a contenere un gran numero di particelle virali, sono presenti molti detriti di tessuto cellulare, prodotti metabolici e altre impurità, che rendono il veleno nello stato torbido o semitorbido, il diretto l'uso di questa operazione di concentrazione del veleno causerà presto il blocco della membrana di ultrafiltrazione e non potrà completare la concentrazione del veleno, con conseguente scarto della membrana di ultrafiltrazione. Pertanto, prima che il veleno venga concentrato, deve essere chiarificato, operazione che di solito avviene mediante centrifugazione a bassa velocità e filtrazione su membrana. Va notato che quando si utilizza la tecnologia di separazione a membrana, poiché il materiale della membrana è spesso dotato di elettronegatività o gruppi idrofobici, è necessario indagare se il materiale della membrana ha adsorbimento alle particelle virali.

Una fase di chiarificazione efficiente richiede una combinazione di elevata capacità di rimozione delle particelle solide ed elevata resa del prodotto, facile amplificazione e protezione delle successive unità operative a valle. Attualmente, il filtro profondo viene utilizzato per le operazioni di chiarificazione.

Tuttavia, quando la scala di coltivazione è troppo grande, sarà necessario un gran numero di membrane filtranti profonde, con un conseguente aumento sostanziale del costo dei materiali di consumo. Allo stesso tempo, l’elevata densità della coltura cellulare ridurrà il carico della membrana del filtro profondo, con conseguente aumento dei costi e un’eccessiva diluizione del prodotto.

Il metodo di microfiltrazione utilizza principalmente un dispositivo di filtraggio a flusso tangenziale e i componenti della membrana sono cassette a membrana piatta e fibra cava. La filtrazione a flusso tangenziale (TFF) è guidata dalla differenza di pressione transmembrana. Le sostanze e le impurità più piccole della dimensione dei pori della membrana passano attraverso la membrana, mentre le impurità come le cellule con particelle più grandi vengono intrappolate. La dimensione dei pori della membrana utilizzata per la microfiltrazione è {{0}},45/0,22μm. La microfiltrazione a flusso tangenziale a fibra cava può elaborare direttamente liquidi ad alto contenuto solido, come un terreno di coltura cellulare ad alta densità, può eliminare le fasi di centrifugazione e pre-filtrazione con meno passaggi e un funzionamento semplice, la membrana può essere utilizzata ripetutamente attraverso la pulizia, riducendo l'investimento e il funzionamento delle apparecchiature costi, in linea con le esigenze della produzione modulare automatizzata.

Concentrazione e purificazione

Dopo un chiarimento preliminare, il terreno di coltura del virus contiene ancora un gran numero di impurità, comprese particelle difettose, involucro virale, citotossina, terreno, siero e frammenti cellulari, ecc. Se queste impurità vengono iniettate negli animali, non solo influenzeranno l'efficacia del vaccino, ma provocano anche una forte risposta immunitaria dell’ospite e portano addirittura alla morte degli animali vaccinati. Pertanto, sono necessarie concentrazione e purificazione per rimuovere impurità come eteroproteine ​​e frammenti cellulari, potenziare e indurre risposte immunitarie efficaci, ridurre la quantità di vaccino utilizzato e ridurre le reazioni avverse.

Il principio della purificazione del virus: mantenere l'attività biologica e l'infettività del virus come premessa, rimuovere le impurità del virus ed estrarre l'elevata purezza del virus.

Attualmente, i principali metodi di concentrazione e purificazione utilizzati nella produzione su larga scala sono l'ultrafiltrazione.

Metodo di ultrafiltrazione, utilizza principalmente un dispositivo di ultrafiltrazione a flusso tangenziale, un sistema di filtrazione a fibra cava e altre apparecchiature di filtrazione. In circostanze normali, l'applicazione del metodo di ultrafiltrazione può far sì che il virus si concentri più di 100 volte, con un tasso di rimozione dell'eteroproteina fino al 99%. Tra questi, la tecnologia di filtrazione a membrana a fibra cava presenta i vantaggi di una forza di taglio lieve e bassa, un facile collegamento, un funzionamento flessibile, una lunga durata, un basso costo e una facile amplificazione, quindi si consiglia di scegliere la fibra cava per la concentrazione e la purificazione del virus.

Quando si utilizza il metodo di ultrafiltrazione per la concentrazione e la purificazione, è molto importante selezionare la dimensione appropriata dei pori della membrana, che determina direttamente l'efficienza e la qualità della concentrazione. Da un lato, è necessario selezionare l'apertura della membrana per intrappolare efficacemente le molecole bersaglio per garantire la resa e, dall'altro, è necessario considerare pienamente l'effetto di rimozione e la velocità di elaborazione delle eteroproteine. Pertanto, il principio migliore è selezionare la membrana con la dimensione dei pori più grande in grado di intrappolare la molecola bersaglio e provare a selezionare la membrana filtrante con una distribuzione uniforme delle dimensioni dei pori.

Il virus della diarrea epidemica suina (PEDV) e il virus della gastroenterite trasmissibile (TGEV) sono entrambi coronavirus, che sono sfere polimorfiche, con punte simili a punte capovolte, di diametro compreso tra 60 e 190 nm. La malattia da rotavirus è una malattia zoonotica in cui il rotavirus (RV) ha l'aspetto di una ruota e ha un diametro di circa 70 nm. Questi tre virus possono generalmente essere intercettati utilizzando membrane di ultrafiltrazione con apertura 100-750kd.

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