Purificazione a valle-su scala industriale dei batteriofagi: sezione "Chiarificazione" e "Ultrafiltrazione"

I batteriofagi, noti anche come fagi, sono virus che infettano i batteri. Un fago non può sopravvivere da solo; deve parassitare un batterio ospite per riprodursi, provocando infine la lisi del batterio. A causa delle loro proprietà uniche, i fagi possono essere utilizzati clinicamente per l'identificazione e la tipizzazione batterica, nonché per il trattamento di alcune infezioni batteriche refrattarie.

Questo è un diagramma schematico della struttura di un batteriofago (fonte immagine: Internet).

 

Si stima che le malattie delle piante causino ogni anno oltre il 30% delle perdite globali di resa agricola. Tra i vari agenti patogeni, le malattie batteriche sono particolarmente difficili da controllare. I metodi di controllo tradizionali si basano principalmente su antibiotici e agenti a base di rame-. Tuttavia, l'uso eccessivo di antibiotici ha portato a una resistenza antimicrobica sempre più grave, mentre l'uso a lungo-termine dei composti del rame provoca un accumulo nell'ambiente, con rischi per la salute degli esseri umani e degli animali.

 

Poiché i batteriofagi hanno un’elevata specificità, possono uccidere selettivamente i batteri patogeni senza danneggiare i microbi benefici o altre cellule ospiti. Pertanto, i fagi possono fungere da alternative agli antibiotici e agli agenti a base di rame-. Attraverso la terapia fagica, gli agenti patogeni possono essere eliminati efficacemente riducendo l’uso di antibiotici e composti di rame.

 

Con i continui progressi scientifici e tecnologici e la ricerca più approfondita sui batteriofagi, le prospettive di utilizzo dei fagi per trattare i superbatteri stanno diventando sempre più promettenti. Si prevede che in futuro la terapia fagica diventerà una delle soluzioni chiave alla resistenza agli antibiotici. Attraverso la ricerca e l’esplorazione continue, la terapia fagica potrebbe emergere come una forza importante nel campo del trattamento antimicrobico, apportando maggiori contributi alla salute umana.

 

Tuttavia, per somministrare in modo sicuro ed efficace i batteriofagi al corpo umano-soprattutto tramite iniezione endovenosa (IV)-rimane una sfida importante:come ottenere preparazioni fagiche ultra-pure.

Il lisato fagico è una miscela complessa che, oltre ai fagi bersaglio, contiene importanti impurità quali: batteri ospiti e loro frammenti, DNA genomico e proteine ​​ospiti (impurezze correlate all'ospite-); endotossine come lipopolisaccaridi (LPS) (impurità legate al processo-); e impurità correlate al prodotto-compresi capsidi vuoti e code rotte.

Pertanto, l'obiettivo della purificazione non è solo quello di ottenere un titolo fagico elevato ma anche di ridurre le impurità-in particolare le endotossine, il DNA ospite e le proteine-a livelli estremamente bassi come specificato dagli standard della farmacopea.

Un processo di purificazione dei fagi robusto e scalabile generalmente segue i principi comuni dell'elaborazione a valle e può essere suddiviso nei seguenti passaggi logici:

Processo di purificazione a valle dei batteriofagi

 

Chiarificazione – Rimozione delle impurità macroscopiche

Nella fase iniziale della purificazione del batteriofago, l'obiettivo principale della fase di chiarificazione è rimuovere in modo efficiente le cellule batteriche intatte e i detriti cellulari di grandi dimensioni dal lisato grezzo. Lo scopo principale di questa fase è fornire un'alimentazione pulita per le colonne cromatografiche a valle o le unità di separazione a membrana, riducendo al minimo il carico di particolati solidi. Ciò previene efficacemente l'intasamento nelle successive unità di purificazione, garantendo un funzionamento stabile e un'elevata efficienza del processo durante tutto il flusso di lavoro di purificazione.

Nei tradizionali processi a valle dei batteriofagi, la chiarificazione si basa in genere su una centrifugazione a bassa-velocità combinata con una filtrazione di profondità a più stadi-che di solito passa in sequenza attraverso filtri da 0,8μm, 0,45μm e 0,22μm-per rimuovere efficacemente i detriti e le impurità della cellula ospite. Sebbene maturo e affidabile, questo approccio prevede più passaggi, richiede tempo-e richiede ripetuti trasferimenti di materiale, lasciando spazio all'ottimizzazione della resa e dell'efficienza complessive.

 

Sostituzione del filtraggio di profondità multi-fase con acapsula di microfiltrazionepuò semplificare e intensificare significativamente il processo. Nello specifico, dopo aver rimosso la maggior parte dei detriti cellulari mediante centrifugazione a bassa-velocità, il lisato può essere elaborato direttamentefiltrazione a flusso tangenziale (TFF)utilizzando capsule di microfiltrazione con dimensioni dei pori definite (0,45μm o 0,22μm). Ciò consente la rimozione fine delle impurità particellari e l'efficiente permeazione dei fagi bersaglio in aunico passo, integrando efficacemente le tradizionali tre fasi di filtrazione in una.

Questa innovazione non solo riduce notevolmente i tempi operativi e la gestione manuale, ma minimizza anche la perdita di campione e il rischio di contaminazione causati da più fasi di filtrazione, migliorando così il recupero complessivo dei fagi. Nel frattempo, il funzionamento del flusso tangenziale riduce le incrostazioni della membrana, migliora la produttività e rafforza la robustezza del processo.

 

Pertanto, adottando unstrategia di chiarificazione integrata che combina centrifugazione a bassa-velocità e capsule di microfiltrazionerappresenta un approccio efficace per migliorare l'efficienza e il rapporto costo-efficacia della produzione di batteriofagi su larga scala. Le capsule di microfiltrazione di Guidling Technology possono in genere ridurre la torbidità dell'alimentazione al di sotto20 NTU, soddisfacendo pienamente i requisiti delle successive fasi di ultrafiltrazione e cromatografia.

 

Cattura e Concentrazione – Purificazione Primaria e Riduzione del Volume

Durante ilcattura e concentrazionefase di purificazione del batteriofago, l'obiettivo principale è recuperare in modo efficiente i fagi da grandi volumi di lisato chiarificato ottenendo contemporaneamente la concentrazione del prodotto primario e lo scambio di buffer. Questo passaggio si basa principalmente suFiltrazione del flusso tangenziale (TFF)tecnologia.

 

Il principio del TFF risiede nell'uso di membrane di ultrafiltrazione con specifici limiti di peso molecolare-(tipicamente 100 o 300 kDa). Piccole impurità molecolari come componenti residui del terreno di coltura, metaboliti e piccole proteine ​​passano selettivamente attraverso i pori della membrana, mentre i fagi vengono trattenuti nel retentato a causa dellaeffetti di esclusione dimensionale, consentendo la loro effettiva separazione e arricchimento.

All’interno di un sistema TFF,modalità di ultrafiltrazioneviene impiegato per raggiungere la concentrazione del volume, mentre si passa amodalità di diafiltrazioneconsente lo scambio di buffer, creando così condizioni fisico-chimiche adatte per fasi successive come il trattamento enzimatico.

Questa tecnologia offre i vantaggi combinati dielevata efficienza di elaborazioneEeccellente scalabilità, rendendolo ideale per la produzione-su larga scala. Secondo GuidlingTechnology, le capsule di ultrafiltrazione raggiungono tipicamente untasso di recupero dei fagi del 90-95%, a seconda del materiale specifico in lavorazione.

 

Purificazione profonda – Rimozione mirata delle impurità critiche

Nella purificazione dei batteriofagi,purificazione profondaè il passaggio fondamentale che determina la qualità del prodotto finale. Il suo obiettivo primario è ilrimozione specifica delle impurità critiche, come le endotossine. TradizionaleCentrifugazione in gradiente di densità di CsCl-a causa della sua tossicità e della mancanza di scalabilità-è stato eliminato dai processi industriali. Gli approcci attuali si concentrano sutecnologie basate sulla-cromatografia, con l'integrazione innovativa dipretrattamento enzimatico.

 

Una combinazione di strategie avanzateCromatografia a scambio anionico (AEC)conpretrattamento con fosfatasi alcalina (AP).è stato sviluppato. Sia i fagi che i lipopolisaccaridi (LPS) trasportano cariche negative, portando alla competizione per i siti di legame nei processi AEC convenzionali e causando una co-eluizione che riduce l'efficienza della purificazione. Introducendo il pretrattamento AP prima del caricamento AEC, l'enzima rimuove specificamente i gruppi fosfato dalle regioni del lipide A e dei polisaccaridi centrali delle molecole LPS, riducendo significativamente la loro carica negativa netta. Ciò indebolisce efficacemente la loro affinità per il mezzo di scambio anionico.

I dati sperimentali mostrano che trattando il campione con20 U/mL APseguita dalla purificazione utilizzandoadsorbitori di membrana con ligando di ammina quaternaria (Q) o colonne monolitichepuò raggiungere fino aRimozione delle endotossine del 98,8%., pur mantenendo eccellenti tassi di recupero dei fagi. Questo approccio risolve con successo il problema di lunga data del co{2}}adsorbimento delle endotossine durante la purificazione dei fagi

Lucidatura – Raffinazione finale e formulazione

 

In finalefase di lucidaturadella purificazione dei batteriofagi, l'obiettivo principale è raggiungere la massima purezza e prontezza della formulazione. Ciò include la rimozione di tracce di impurità residue, l'eliminazione degli additivi introdotti durante il processo (come la fosfatasi alcalina) e la sostituzione completa del prodotto in un sistema tampone compatibile con la formulazione.

Ciò viene in genere ottenuto tramitediafiltrazione secondaria, un metodo collaudato ed efficiente che consente sia la rimozione profonda di piccole-molecole contaminanti sia lo scambio accurato di tamponi.

 

Per migliorare ulteriormente la purezza del prodotto,cromatografia di interazione del legame idrogeno-Ocromatografia in modalità-mista (MMC)può essere introdotto come afase finale di lucidatura. Queste tecniche utilizzano meccanismi di separazione multidimensionale per rimuovere componenti in traccia con proprietà fisico-chimiche simili a quelle del fago bersaglio. Il risultato è un ingrediente farmaceutico attivo batteriofago (API) altamente purificato che soddisfa i rigorosi standard di qualità richiestiformulazioni per iniezione-.

Selezionando una combinazione di moduli di membrana per microfiltrazione e ultrafiltrazione con un'area della membrana di 1 m², il volume massimo stimato di batteriofago che può essere processato arriva fino a 100 L. Il flusso del materiale di microfiltrazione è di circa 20–50 LMH e il flusso del materiale di ultrafiltrazione è di circa 15–30 LMH. Rispetto ai metodi di lavorazione tradizionali, questo approccio può soddisfare in modo efficiente i requisiti di processo sia per la chiarificazione che per l'ultrafiltrazione.

Riferimenti:

Saavedra et al.,Purificazione scalabile di preparati batteriofagi (2025)

Lapras et al.,Razionalizzazione del processo di purificazione di un ingrediente farmaceutico fagico attivo (2024)