Tecnologia delle membrane e chiarimento sui vaccini (Ⅰ)
I vaccini provengono da diverse fonti, tra cui estratti di tessuti, cellule batteriche, particelle virali, proteine e acidi nucleici prodotti da cellule ricombinanti di mammiferi, cellule di lievito e di insetti.
Il metodo più comune di produzione di vaccini si basa su un processo di fermentazione iniziale seguito da purificazione. La produzione di vaccini è un processo complesso che coinvolge molti passaggi e processi diversi. La scelta del metodo di purificazione corretto è fondamentale per ottenere la purezza desiderata del prodotto finale. La chiarificazione dei vaccini è un passaggio importante che ha un impatto significativo sul recupero del prodotto e sulla successiva purificazione a valle. Per chiarificare i vaccini possono essere utilizzate diverse tecniche. La scelta del metodo di raccolta e dell'attrezzatura dipende dal tipo di batteria, dalla natura del prodotto raccolto e dal liquido di processo. Queste tecniche includono la filtrazione a membrana (microfiltrazione, filtrazione a flusso tangenziale), la centrifugazione e la filtrazione profonda (filtrazione a flusso normale). Da una lunga esperienza, la chiarificazione della raccolta del vaccino viene solitamente ottenuta tramite centrifugazione seguita da filtrazione profonda.
Negli ultimi anni, le tecniche basate sulle membrane hanno acquisito importanza nella chiarificazione dei vaccini. I processi upstream utilizzano sempre più tecnologie monouso, quindi le strategie di raccolta devono cambiare. Questo articolo fornisce una panoramica completa delle diverse tecnologie basate sulle membrane e delle loro applicazioni nella chiarificazione dei vaccini.
01 Introduzione
I vaccini sono una componente fondamentale della nostra prevenzione delle malattie infettive, che rimangono una causa scioccante di morte. Tra 2 e 3 milioni di persone vengono salvate da difterite, tetano, pertosse e morbillo ogni anno grazie all'immunizzazione. I vaccini coprono un'ampia gamma, da piccole proteine ricombinanti a intere particelle di virus e interi batteri. Possono essere prodotti da diversi sistemi: uova, cellule di mammiferi, batteri, ecc. A causa della complessità e della diversità dei vaccini, attualmente non esiste un protocollo o un modello di purificazione mainstream, nonostante il crescente interesse per le piattaforme vaccinali.
In genere, un processo di vaccinazione può essere suddiviso in tre parti: upstream (produzione e chiarificazione), trattamento downstream (purificazione, inclusa ultrafiltrazione, cromatografia e trattamento chimico) e formulazione (operazioni di riempimento finale). Indipendentemente dal sistema di produzione, la chiarificazione (la rimozione iniziale di sostanze indesiderate) svolge un ruolo chiave nel determinare un processo di purificazione robusto. Una fase di chiarificazione adeguata rimuove principalmente cellule intere, detriti cellulari, colloidi e grandi aggregati per ridurre l'onere della lavorazione downstream. In alcuni casi, la chiarificazione può anche ridurre impurità insolubili, proteine delle cellule ospiti (HCP) e acidi nucleici delle cellule ospiti. Come qualsiasi altra fase di purificazione, la fase di chiarificazione deve essere ottimizzata per ottenere la massima resa e purezza del prodotto, adattandosi al contempo alla specificità e ai vincoli di produzione del vaccino.
A causa dell'eterogeneità dei tipi di vaccino, per la chiarificazione vengono utilizzate diverse tecniche, tra cui la centrifugazione o la filtrazione (Tabella 1).
Di solito sono necessarie diverse serie di operazioni per ottenere la chiarificazione desiderata. La prima operazione è progettata per rimuovere particelle più grandi (chiarificazione primaria) e la seconda operazione è progettata per rimuovere colloidi e altre particelle sub-micron (chiarificazione secondaria). La centrifugazione a bassa velocità funge da opzione di chiarificazione una tantum, consentendo la rimozione di cellule e detriti cellulari tramite precipitazione. La centrifugazione può gestire carichi solidi elevati ed è stata ampiamente utilizzata in modalità batch o continua e centrifughe a disco. Richiede elevati investimenti di capitale e costi di manutenzione e affronta sfide nell'aumento di scala a causa della mancanza di un modello di riduzione affidabile. Tuttavia, alcuni produttori di vaccini commerciali utilizzano centrifughe nella produzione su larga scala che comporta elevati volumi di lavorazione e più attività di produzione.
La filtrazione di chiarificazione può essere eseguita tramite filtrazione a flusso normale (NFF, nota anche come filtrazione a fondo cieco) o filtrazione a flusso tangenziale (TFF, nota anche come filtrazione a flusso incrociato). Esistono anche modalità di filtrazione specifiche (filtri profondi) che contengono materiali caricati positivamente e AIDS filtranti che migliorano la ritenzione di detriti cellulari, colloidi e componenti indesiderati caricati negativamente.
I filtri a membrana trattengono le particelle per esclusione dimensionale e non hanno un'elevata capacità di ritenzione dello sporco, quindi sono adatti per fasi di chiarificazione secondaria. Sia i filtri profondi che i filtri a membrana sono facili da scalare e implementare (semplice progettazione del sistema). A differenza di NFF, TFF è utilizzato principalmente per la chiarificazione primaria (microfiltrazione). Membrane con un intervallo di cut-off di 0.1-0.65 μm (preferibilmente con un canale aperto) sono state utilizzate con successo per trattenere cellule, detriti cellulari e altri grandi contaminanti. La maggior parte delle apparecchiature TFF è linearmente scalabile e riutilizzabile dopo la pulizia, il che riduce significativamente il costo dei materiali di consumo per la fase.
La fase di chiarificazione si colloca tra i processi a monte e a valle e talvolta viene trascurata durante lo sviluppo del processo del vaccino perché tempo e risorse sono prioritari per altre fasi di purificazione, come la cromatografia o la centrifugazione in gradiente di densità.
Anche i brevetti per i processi di produzione dei vaccini spesso omettono la fase di chiarificazione. L'efficienza di chiarificazione influisce direttamente sulle prestazioni del processo a valle. Una fase di chiarificazione scarsamente ottimizzata può influire negativamente sulla capacità del filtro sterilizzato o può ridurre la durata utile della resina cromatografica. Oggi, aspettative normative più severe tendono a far sì che i produttori di vaccini producano vaccini più puri, ben caratterizzati ma accessibili. In questo caso, ogni fase deve ricevere l'attenzione che merita. Le tendenze attuali suggeriscono che il processo a monte si sta muovendo verso un sistema di espressione "più pulito" (ad esempio, le cellule coltivate in terreni privi di siero sostituiscono le uova) con una maggiore produttività e una maggiore densità cellulare.
I processi di purificazione a valle vengono semplificati e snelliti per aumentare la purezza del prodotto finale. Per gestire questi cambiamenti, la fase di chiarificazione non può diventare un collo di bottiglia. In questo caso, la tecnologia di filtrazione incontra una nuova sfida di chiarificazione, affrontando i problemi di una maggiore flessibilità del processo, la possibilità di un uso singolo e costi di investimento ridotti.
02 Chiarimenti sui vaccini virali
Diversi tipi di metodi di chiarificazione, da soli o in combinazione, sono stati utilizzati con successo per chiarificare il raccolto all'estremità di alimentazione dei vaccini.
Scala pilota: 1-20L, scala di produzione: più di 20L
2.1 Precauzioni per la chiarificazione del vaccino virale
Molti vaccini contengono tutte o parte delle particelle del virus per formare l'immunità contro l'infezione virale. In genere rientrano in quattro ampie categorie:
Vaccino vivo attenuato (LAV), che si basa su un ceppo indebolito del virus per ridurne la virulenza. I virus attenuati possono replicarsi nel corpo ma non sono patogeni.
- Vaccini a virus inattivati (IV), che contengono virus inattivati chimicamente o tramite ultravioletti per eliminare l'infettività. Le particelle virali possono essere complete, divise o purificate (solo proteine antigeniche).
- Il vaccino a vettore virale (VV) è un virus attivo e non patogeno che presenta l'antigene di un virus patogeno. Queste strutture sviluppate di recente sono utilizzate anche per applicazioni di terapia genica.
Vaccini a particelle virus-simili (VLP), una classe specifica di vaccini a subunità virali che imitano la struttura complessiva delle particelle virali ma non contengono materiale genetico infettivo.
Nella maggior parte dei casi, le particelle virali sono completamente intatte durante la fase di chiarificazione, anche durante la lisi del vaccino virale (la scissione viene solitamente effettuata a valle, in un ambiente più purificato).
La sfida principale della chiarificazione virale è il recupero di particelle virali ad alta resa, rimuovendo in modo efficiente detriti cellulari, grandi aggregati e contaminanti insolubili. Come descritto nelle sezioni seguenti, ci sono diversi fattori che possono causare la degradazione o la perdita del virus. Inoltre, la resa virale può essere difficile da considerare a causa dell'elevata variabilità dei metodi di analisi quantitativa virale in questa fase del processo, in particolare per i vaccini LAV e VV. Per questi vaccini, la resa virale viene spesso valutata utilizzando test di infettività come il test della placca o il test TCID 50. Il fatto che alcuni dei composti raccolti possano interferire con la capacità del virus di infettare le cellule indicatrici aumenta la variabilità di questo approccio quantitativo.
2.2 Strategia di chiarimento del vaccino contro il virus
I vaccini virali variano notevolmente per dimensioni, struttura, forma e sistemi di espressione (tabella 3).
Di conseguenza, non esiste generalmente alcun modello per i suoi processi a valle, in particolare per le fasi di chiarificazione. In teoria, tutte le tecniche disponibili (centrifuga a bassa velocità, microfiltrazione TFF, NFF) possono essere selezionate e potenzialmente combinate per chiarire il virus. Infatti, il successo dei metodi di chiarificazione è influenzato dal sistema di espressione e dalle proprietà fisico-chimiche dei virus coinvolti.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} cellule/ml) utilizzando polimeri cationici, ha ridotto l'area di filtrazione profonda di 4 volte rispetto ai metodi tradizionali. Questa tecnica consente la raccolta di fermentatori di grande capacità senza l'uso di centrifughe. Analogamente, Riske et al. hanno dimostrato che il trattamento con chitosano di colture cellulari da 40 L (0,02%) contenenti l'1,4-2,6% di solidi ha portato a un aumento di 7- volte della capacità di filtrazione assoluta dopo la filtrazione profonda.
Menzionano anche che il chitosano sembra migliorare l'efficienza di chiarificazione flocculando particelle submicroniche, che in genere si depositano nelle centrifughe. È probabile che i metodi di pretrattamento e flocculazione continuino a far parte delle future chiarificazioni di filtrazione dei vaccini. I penetranti, tra cui zuccheri, glicoli e amminoacidi, flocculano preferibilmente i virus. La flocculazione virale con soluzione osmotica seguita da microfiltrazione 0.2µ può essere utilizzata come processo completo per la purificazione dei virus. I penetranti possono stimolare l'aggregazione virale riducendo lo strato di idratazione attorno alle particelle per flocculare particelle virali idrofobiche non incapsulate e particelle virali incapsulate. Sebbene sia stato dimostrato che i penetranti flocculano i virus, il metodo ha il potenziale per essere una piattaforma per la futura purificazione dei vaccini e la sua fattibilità nella purificazione dei vaccini pilota o su larga scala non è stata dimostrata. Il metodo di pretrattamento della flocculazione, che è probabile che continui a far parte della futura chiarificazione del filtro dei vaccini, viene eseguito in un fermentatore da 2L. Per poter essere potenzialmente utilizzati in operazioni di produzione su larga scala, questi metodi devono essere convalidati su scala pilota e di produzione.
2.2.1 Esprimere l'impatto del sistema
Il metodo di chiarificazione dipende principalmente dal tipo di processo a monte e dal sistema di espressione, che determina il tipo e il livello di contaminanti da rimuovere. I vaccini virali sono solitamente prodotti in embrioni di pollo da linee cellulari continue di mammiferi o uccelli o cellule di baculovirus/insetti, che sono un sistema di espressione più complesso. Alcuni tipi di VLP possono anche essere prodotti da altri sistemi di espressione eterologhi (batteri, lievito, cellule vegetali).
2.2.1.1 Virus prodotto nell'embrione di pollo
I vaccini sono stati prodotti nelle uova per decenni. Questo lavoro risale al 1931, quando Woodruff e Good Pasture hanno utilizzato con successo la membrana corio-allantoidea delle uova fertili come substrato per la crescita virale. Oggi, molti vaccini umani e veterinari sono ancora prodotti utilizzando questo antico processo. Il più noto è probabilmente il vaccino antinfluenzale stagionale. Il principio è quello di inoculare le uova di gallina con i virus di interesse e poi replicare nella membrana corio-allantoidea. Dopo la riproduzione, il fluido allantoico ricco di particelle virali viene raccolto e purificato.
Il fluido allantoico è un alimento chiarificante impegnativo. Il suo alto contenuto di minerali e proteine (inclusa l'ovalbumina) gli conferisce un'elevata viscosità. Il fluido allantoico contiene anche composti tissutali essenziali di embrioni di pollo, come piume, becchi, vasi sanguigni o cellule del sangue. A causa dell'alto contenuto di solidi, la centrifugazione a bassa velocità è l'opzione preferita per la chiarificazione primaria, che in genere si traduce in un tasso di recupero di circa il 70%. Tuttavia, è anche possibile la chiarificazione primaria mediante tecniche di filtrazione. Per NFF, i filtri profondi a base di polipropilene e cellulosa hanno buone capacità di raccolta del fluido allantoico. I filtri di superficie realizzati con filtri profondi a base di polipropilene o cellulosa possono avere una capacità di 150-210 L/m² e ridurre la torbidità del flusso di alimentazione fino a 3 volte. Il dispositivo TFF a canale di alimentazione aperto è adatto anche per la chiarificazione del fluido allantoico, poiché il dispositivo è più adatto per una perdita di pressione minima attraverso il canale di alimentazione, riducendo così l'ostruzione del canale.
La fase di chiarificazione secondaria può essere eseguita facilmente con NFF. Una combinazione di materiali in polipropilene, cellulosa e fibra di vetro mostra generalmente una buona efficienza e un'alternativa alla fase di chiarificazione secondaria è quella di utilizzare TFF e un dispositivo a membrana di microfiltrazione da {{0}}.65μm o 0.45μm e azionare il controllo del flusso osmotico. In questa fase è possibile utilizzare un dispositivo TFF a canale aperto con una membrana idrofila in PVDF o PES.
È importante notare che le particelle virali possono essere associate a materiale di detriti insolubili, il che può ridurre significativamente la produzione virale durante la chiarificazione. L'uso di una soluzione salina può ridurre questa associazione tra virus influenzali e frammenti solidi, con conseguente aumento di circa il doppio della produzione senza compromettere l'integrità delle particelle virali.
2.2.1.2 Virus prodotti in linee cellulari successive di mammiferi e uccelli
Di recente, alcuni vaccini virali si sono allontanati dai processi basati sulle uova a favore di processi basati sulle colture cellulari (in particolare per i vaccini antinfluenzali). Il motivo principale di questo passaggio è prevenire i problemi di produzione del vaccino associati alle uova embrionali (ad esempio una carenza di fornitura di uova che potrebbe verificarsi in caso di focolaio di malattie avicole). Di conseguenza, molti tipi di vaccini e vettori virali sono attualmente sviluppati utilizzando linee cellulari continue da mammiferi o uccelli, linee cellulari convenzionali (come le linee cellulari Vero, MDCK o HEK293) o linee cellulari proprietarie.
A seconda del sistema di espressione, il virus può rimanere all'interno della cellula, richiedendo una fase di lisi cellulare, oppure può rimanere all'esterno della cellula (lisi o gemmazione). Il carico solido e il contenuto solubile ottenuti dalla coltura cellulare sono molto più puliti della fase liquida allantoica. Di conseguenza, la tecnologia NFF è più facile da implementare e la capacità è significativamente più elevata. Tuttavia, la capacità di filtrazione dipende fortemente dalle condizioni della coltura cellulare, come la densità cellulare o la vitalità cellulare al momento della raccolta. Questi parametri influenzano la quantità di detriti cellulari e macroaggregati che possono intasare filtri profondi e membrane, con conseguente riduzione della capacità.
Thomassen et al forniscono un buon esempio di chiarificazione NFF. Utilizzato nel processo di produzione del poliovirus inattivato (IPV). Le cellule Vero coltivate su microcarrier sono state utilizzate per la proliferazione virale con una densità cellulare di {{0}}.78 x 106 cellule/ml TOI. Per la pre-chiarificazione viene utilizzato uno schermo in acciaio inossidabile da 75 μm per rimuovere i microcarrier dal raccolto. La classificazione a doppio strato viene chiarificata utilizzando un filtro profondo a densità (0.2-2.0 μm), seguito da un filtro di grado sterilizzato.
L'unità monouso scalabile selezionata è stata utilizzata con successo per la preparazione del materiale di sperimentazione clinica Sabin IPV su scala da 350 L. A seconda del sierotipo del virus, si ottiene un tasso di recupero del virus dal 86 al 96 percento.
2.2.1.3 Baculovirus/particelle simili a virus prodotte nel sistema cellulare degli insetti
La considerazione dei sistemi baculovirus/cellule di insetto per la produzione di vaccini su larga scala è relativamente nuova, ma sta suscitando un interesse crescente nel campo dei vettori virali e delle VLP. Il vantaggio principale di questo sistema è che comporta una produzione di breve durata (nessuna necessità di stabilire linee cellulari) e sicura (nessun DNA virale completo). Ci sono anche alcuni svantaggi, come la necessità di rimozione del baculovirus e la stabilità del prodotto.
Cervarix, un vaccino VLP contro l'infezione da papillomavirus umano prodotto da GlaxoSmithKline, è il primo vaccino umano ad essere prodotto commercialmente in cellule di insetto. Sono attualmente in fase di sviluppo diversi vaccini basati su VLP e vettori rAAV prodotti in cellule di insetto infette da baculovirus. Le linee cellulari di insetto derivate dal verme autunnale Spodoptera frugiperda (Sf9 e Sf21) e dal verme del cavolo Trichoplusia ni (cellule BTI-TN5B1-4) sono le più comunemente utilizzate per la loro capacità di crescere in sospensione, il che semplifica l'amplificazione del processo a monte. Dopo essere cresciute fino alla densità desiderata di cellule viventi, queste cellule vengono infettate con baculovirus ricombinante nella fase di crescita cellulare esponenziale per l'espressione proteica. Il grande genoma dei baculovirus consente l'espressione di cinque o più proteine diverse, il che corrisponde alla complessità dei vettori VLP e virali.
Bernard et al. hanno descritto il processo a valle della coltura cellulare di insetti. Il processo è altamente variabile, riflettendo la diversità delle proteine prodotte con questa tecnica. Il primo passaggio della sequenza di purificazione è fortemente influenzato dalle caratteristiche del volume del bioreattore (ad esempio, densità e vitalità cellulare) o dalla natura del rilascio del prodotto (secreto per gemmazione o lisi cellulare). L'infezione da baculovirus delle cellule di insetti può causare lisi cellulare entro 3-5 giorni. La distruzione delle cellule può portare a un aumento dell'attività proteolitica e ad altri fattori ambientali che possono portare alla degradazione delle proteine ricombinanti.
Ci sono stati tentativi di sviluppare baculovirus con una minore capacità di avviare la lisi cellulare. Il baculovirus lisa meno del 10 percento degli insetti infetti.
La lisi cellulare può essere eseguita utilizzando metodi diversi, come congelamento-scongelamento, detergenti, omogeneizzatori o trattamento a ultrasuoni. Le cellule degli insetti non hanno parete cellulare e quindi si dissolvono rapidamente. Sebbene il trattamento a ultrasuoni sia stato segnalato in molti processi da banco, è raramente utilizzato su scala sperimentale o commerciale. Il metodo più comune è quello di utilizzare un omogeneizzatore per distruggere le cellule in presenza di un detergente a bassa concentrazione (0.1% Triton X-100 o NP-40). L'uso di detergenti e microfluidizzazione o omogeneizzazione a impatto osmotico sono stati impiegati con successo in molti processi di produzione su larga scala. In genere, le cellule di insetto vengono sospese in tamponi di lisi (50 mM TRIS pH7.7, 300 mM NaCl, 5% glicerolo, 0,2 mM PMSF e inibitori della proteasi), durante i quali viene aggiunto Triton-X100 a una concentrazione finale dello 0,1%, seguita da ultrasuoni blandi o microfluidizzazione. La miscela viene quindi centrifugata per rimuovere le particelle insolubili.
In questa fase, il lisato può apparire molto torbido ed è difficile da filtrare utilizzando un filtro da 0.45μm. A volte si possono osservare perdite fino al 30% durante la fase di chiarificazione della pirolisi. L'aggiunta di benzoenzimi nella fase di scissione aiuta a risolvere il problema della filtrazione. La pulizia delle cellule con salamoia tamponata con fosfato dopo la raccolta e un rapido "congelamento-scongelamento" in un sale elevato (500 mM NaCl) contenente il tampone di cracking aiuta a rimuovere gli aggregati.
La chiarificazione delle VLP e dei vettori virali prodotti dalle cellule degli insetti avviene dopo la lisi cellulare (mediante trattamento chimico o meccanico), che rilascia non solo particelle virali ma anche grandi quantità di acido nucleico cellulare. Le cellule degli insetti sono in grado di crescere a un'elevata densità cellulare, da 1-9.10 6 cellule/ml. Pertanto, la fase di chiarificazione dovrebbe riguardare un'elevata densità cellulare, un elevato contenuto di acido nucleico e, se possibile, la rimozione delle particelle di baculovirus. Per complicare ulteriormente le cose, le VLP o i vettori virali e i baculovirus possono avere dimensioni simili (i baculovirus sono larghi 60-80 nanometri e lunghi 300-400 nanometri). A causa dell'elevata densità cellulare, la centrifugazione è stata la tecnica preferita per la chiarificazione primaria per decenni. Tuttavia, i processi a membrana sembrano essere un'alternativa molto interessante perché la scalabilità è facile da definire.
I filtri profondi sono stati utilizzati efficacemente nel processo a valle di particelle simili a rotavirus a tre strati. A livello di laboratorio, il metodo di ultracentrifugazione a gradiente di densità di CsCl viene spesso utilizzato per purificare queste particelle complesse. I ricercatori hanno valutato non solo la fase di chiarificazione del filtro profondo, ma anche l'intero processo a valle (scissione di Triton X-100 e filtrazione profonda, seguita da ultrafiltrazione ed esclusione delle dimensioni delle particelle). I risultati mostrano che la resa del gradiente di densità di CsCl può raggiungere il 37%.
Il metodo ultracentrifugo è circa l'10%. Come altro esempio, sono state utilizzate fibre cave da 0,45 μm e fibre di diametro fine da 500 kDa per recuperare e concentrare particelle simili all'HIV prodotte nelle cellule degli insetti. In questo studio, la forza di taglio delle fibre cave è stata ottimizzata in base all'integrità cellulare. Risultati È stato stabilito un processo a bassa forza di taglio per sostituire l'ultracentrifugazione a gradiente di zucchero da tavola.
Il processo ha il potenziale per essere applicato alla produzione di massa. I filtri profondi sono stati utilizzati con successo anche nella produzione di virus adeno-associati ricombinanti. La lisi cellulare è stata eseguita con un jammer cellulare meccanico a due pistoni, seguito da un trattamento con nucleasi. Nella fase di chiarificazione, è stato utilizzato un elemento filtrante profondo in fibra di vetro da 1,2 μm, seguito da due strati di PES idrofilo 0.8 μm e PES idrofilo 0.2 μm. I filtri di dimensioni proporzionali sono utilizzati per lotti di processo da più piccoli a dimensioni di 2 00 L. I filtri profondi sono stati utilizzati con successo e anche le classificazioni TFF con film piatti o fibre cave da 0,2 µm o 0,45 µm sono state segnalate come molto efficaci.
Lo studio di Tecnologica (IBET) presso l'Istituto di biologia sperimentale di Oeiras in Portogallo ha utilizzato NFF per eseguire la chiarificazione del VLP dell'epatite C espresso dai baculovirus senza centrifugazione. Filtri in polipropilene nominali (filtri da 10,5,0,6 e 0,3μm) vengono utilizzati per chiarire la raccolta del VLP. Gli stessi filtri con classificazioni dei pori da 0,6μm e 0,3μm vengono utilizzati per la filtrazione nei centri di raccolta del VLP. Tutti i filtrati studiati sono stati testati per i tassi di recupero HCV-VLP e sono stati confrontati i metodi di filtrazione consigliati. I risultati sono mostrati nella Tabella 4.
I risultati hanno mostrato che il filtro da 5μm-0.3μm ha avuto il recupero di prodotto più elevato (100%) per l'alimentazione VLP dell'epatite C raccolta direttamente. Il filtro in polipropilene da 0,6μm ha avuto il recupero di prodotto più elevato (82%) per l'alimentazione centrale e la clearance del DNA della cellula ospite è stata di circa il 70%.
2.2.1.4 Particelle simili a virus prodotte in sistemi batterici o di lievito
Il tipo di metodo di chiarificazione per i vaccini VLP espressi in sistemi batterici o di lievito dipende dal rilascio di VLP ai mediatori extracellulari. Se le VLP non possono essere secrete in modo efficiente, potrebbero essere necessarie la lisi cellulare o altre fasi di estrazione prima della fase di chiarificazione effettiva. Mentre questo è il gold standard nel settore della chiarificazione delle proteine, la centrifugazione (continua o in batch) espressa in sistemi batterici o basati su lievito, più di recente, i processi a membrana sono diventati un'alternativa molto interessante grazie alla loro facilità di scalabilità e compatibilità con i trattamenti monouso.
Richter e Topell spiegano l'uso della centrifugazione, TFF o una combinazione di entrambi durante la preparazione di VLP prodotte in E. coli chiarificato. Nel loro lavoro, sono state utilizzate membrane TFF da 0.45m per diluire e chiarificare gli omogeneizzati di E. coli a una temperatura di 5 gradi. Notano inoltre che la TFF basata su membrana è adatta per gestire raccolti ad alta viscosità, preferibilmente utilizzando unità TFF con configurazioni a canale aperto.
La chiarificazione centrifuga è stata valutata anche come alternativa al TFF. In questo caso, l'omogenato risultante non è stato diluito ed è stato centrifugato a 4 gradi per 105 minuti, 10000g. Senza trasferire il rivestimento morbido, il surnatante è stato versato fuori dalle particelle e ricentrifugato a 4 gradi e 10.000 g per 60 min. Il surnatante è stato quindi rimosso dalle particelle presenti, diluito con tampone EB (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 e filtrato su un dispositivo di filtraggio sterile da 0,22 m. Ulteriore elaborazione. Secondo quanto riferito, anche il processo di ampliamento della produzione di questo vaccino VLP in Escherichia coli su scala di 800 L è stato chiarito dalla combinazione di centrifugazione e TFF.
Il vaccino ricombinante contro l'epatite E HEV 239 è stato autorizzato in Cina per l'immunizzazione di adulti di età pari o superiore a 16 anni. Gli antigeni del vaccino (VLP) sono espressi in E. coli e l'aumento di scala del processo di produzione dell'antigene è stato dimostrato essere su una scala di 50L. Il prodotto è stato estratto tramite cracking di E. coli e i corpi di inclusione sono stati separati dai frammenti cellulari mediante lavaggio pesante con un tampone contenente il 2% di Triton X-100 e quindi sciolti con un omogeneizzatore di urea 4 M. Il TFF chiarisce il VLP del papillomavirus umano prodotto in Saccharomyces cerevisiae (15L). Il lisato cellulare trattato con nucleasi è stato chiarito mediante microfiltrazione a flusso incrociato in modalità di transfiltrazione utilizzando un filtro a fibra cava da 0,65 μm. Lo stesso processo è utilizzato nella produzione del vaccino. Sebbene solo una manciata di vaccini basati su VLP abbiano raggiunto la scala commerciale, sono in fase di sviluppo diversi vaccini basati su VLP, la maggior parte dei quali sono purificati utilizzando la tecnologia della centrifugazione o della membrana.
Limitati dall'influenza dello spazio, condivideremo la seconda metà del contenuto nel prossimo capitolo. Nel prossimo articolo, condivideremo alcuni casi di chiarimento del vaccino e l'uso di componenti di membrana rilevanti.
Come prima azienda nel circuito di localizzazione, Guidling Technology ha accumulato sufficiente esperienza rilevante nella chiarificazione dei vaccini. Guidling Technology è un'azienda di sviluppo e produzione focalizzata su colture biofarmaceutiche e cellulari, purificazione e separazione. I prodotti sono ampiamente utilizzati in biomedicina, diagnosi, filtrazione di fluidi industriali, rilevamento, chiarificazione, purificazione e processo di concentrazione; Guidling ha sviluppato con successo provette per centrifuga a ultrafiltrazione, cassette a membrana per ultrafiltrazione/microfiltrazione, filtri per la rimozione dei virus, dispositivi di filtraggio a flusso tangenziale, pile a membrana profonda, ecc., che soddisfano pienamente gli scenari applicativi di colture biofarmaceutiche e cellulari.
Le nostre membrane e i nostri filtri a membrana sono ampiamente utilizzati nella concentrazione, estrazione e separazione di prefiltrazione, microfiltrazione, ultrafiltrazione e nanofiltrazione. La nostra ampia gamma di linee di prodotti, dalla piccola filtrazione monouso da laboratorio ai sistemi di filtrazione di tipo produttivo, test di sterilità, fermentazione, coltura cellulare e altro ancora, può soddisfare le esigenze di test e produzione.
