Vaccino da particelle a forma di virus e il suo processo di purificazione a valle

Il vaccino contro le particelle a forma di virus (VLP) è una tecnologia di vaccino che si basa sulla struttura del virus ma non contiene i materiali genetici virali. Stimulano una forte risposta immunitaria imitando la morfologia e gli antigeni di superficie dei virus naturali e forniscono una maggiore sicurezza a causa della loro incapacità di replicare. I vaccini VLP sono un'alternativa migliore ai vaccini tradizionali (attenuati e inattivati ​​dal vivo). Il vaccino VLP non può replicare nel corpo, quindi è adatto a tutti, comprese le donne in gravidanza o quelle con sistemi immunitari compromessi. Inoltre, le proteine ​​capside (comprese altre proteine ​​strutturali) di virus con genomi segmentati, come virus dell'influenza, virus africani e virus bluetongue, possono anche essere usati per sviluppare vaccini VLP senza preoccuparsi di problemi di ricombinazione genetica come vaccini vivi attenuati. In secondo luogo, i VLP sono in grado di imitare la struttura dei virus reali, a differenza dei vaccini inattivati, le cui proteine ​​strutturali possono essere modificate durante l'inattivazione, con conseguente compromissione immunogenica.

 

FICO. 1. Meccanismo di formazione di VLP e VLP chimerici

 

Caratteristiche del vaccino VLP

1. Struttura simile ai virus naturali: i VLP sono autoassemblati da una o più proteine ​​strutturali (come le proteine ​​capside) e le loro dimensioni e forma sono simili ai virus reali.

2. Non infettivo: non contiene il genoma virale, non può replicare o causare malattie.

3. Elevata immunogenicità: la struttura granulare può essere riconosciuta in modo efficiente dal sistema immunitario e attivare le risposte delle cellule B e delle T. Può indurre anticorpi neutralizzanti e immunità cellulare (EG, HIV, vaccini HPV).

4. Alta sicurezza: adatto alle persone con bassa funzione immunitaria (come il vaccino contro l'epatite B VLP).

 

FICO. 2. VACCINI VLP disponibili

 

Sistema di produzione del vaccino VLP

I VLP possono essere prodotti attraverso una varietà di sistemi di espressione, le piattaforme comuni includono:

 

1. Sistema di cellule-baculovirus di insetti:

Vantaggi: elevata resa, basso costo, adatto per un gruppo proteico complesso.

Applicazione: vaccino HPV, vaccino contro l'ebola.

 

2. Cellule di mammifero (ad es. Cellule HEK293):

Vantaggi: le modifiche post-traduzionali sono più vicine all'uomo e adatte ai VLP avvolti (come i vaccini antinfluenzali).

 

3. Sistemi di lievito (ad es. Pichia Pastoris):

Vantaggi: rapido, a basso costo, è stato usato nel vaccino contro l'epatite B.

 

4. Sistemi vegetali (ad es. Cloroplasti di tabacco):

Eclome ecologico e scalabile, in fase di sviluppo (ad esempio, vaccino VLP norovirus).

 

Processo di purificazione a valle del vaccino VLP

La diversità dei sistemi di espressione di VLPS porta alla insuunito dei processi di purificazione a valle.

 

 

FICO. 3 Un diagramma di flusso di processo a valle generale

 

Raccolto e chiarimenti:

In tutti i tipi di terreno di coltura, che si propongono per coltura cellulare, ci sono un gran numero di particelle di virus, così come molti detriti di tessuto cellulare, prodotti metabolici e altre impurità, rendendo il terreno di coltura nuvoloso o semi-palo Pertanto, deve essere chiarito in primo luogo prima della concentrazione, per rimuovere le particelle di grandi dimensioni nel terreno di coltura, in modo che diventi una soluzione traslucida o trasparente e la concentrazione del terreno di coltura può rendere normale il processo di concentrazione e garantire la durata di servizio della membrana ultrafiltrazione. Il chiarimento prima della concentrazione della soluzione di coltura è un collegamento tecnico chiave nel processo di concentrazione.

 

Un processo di chiarimento efficiente richiede una combinazione di elevata capacità di rimuovere particelle solide, elevata resa del prodotto, facilità di ridimensionamento e protezione alle unità operative a valle.

 

Metodo

Centrifugazione: la centrifugazione differenziale rimuove particelle di grandi dimensioni.

Filtrazione profonda: utilizzare un filtro multistage (ad es. 1,2μm → 0. 45μm) per chiarire il surnatante.

Filtrazione a flusso tangenziale (TFF): adatto alla produzione di massa, concentra campioni e rimuove piccole particelle di impurità.

 

Tuttavia, se la scala di coltivazione è troppo grande, la centrifugazione richiede molto tempo, sarà richiesto un gran numero di membrane a filtro profonde, quindi il costo dei materiali di consumo aumenta notevolmente. Allo stesso tempo, l'elevata densità della coltura cellulare ridurrà il carico della membrana del filtro profondo, con conseguente aumento dei costi e di una diluizione eccessiva del prodotto.

 

Esistono due tipi di componenti della membrana TFF: cassetta piatta e fibra cavata. La filtrazione a flusso tangenziale (TFF) è guidata dalla differenza di pressione transmembrana. Le sostanze e le impurità che sono più piccole del poro di membrana passano attraverso la membrana, mentre le impurità come le cellule con particelle più grandi sono intrappolate. La dimensione dei pori della membrana utilizzata per la microfiltrazione è {{0}}. 45/0.22μm. La fibra cava può elaborare direttamente il liquido di contenuto solido elevato, come il terreno di coltura cellulare ad alta densità, può eliminare le fasi di centrifugazione e pre-filtrazione, meno passaggi, funzionamento semplice, membrana può essere utilizzata ripetutamente attraverso la pulizia, riducendo gli investimenti delle attrezzature e i costi operativi, in linea con i requisiti di produzione automatizzata modulare.

 

Concentrazione ultrafiltrazione (TFF):

Obiettivo: ridurre la quantità di trattamento cromatografico, migliorare l'efficienza cromatografica e proteggere la colonna cromatografica.

In generale, l'ultrafiltrazione (TFF) può concentrarsi più di 100 volte di VLP e il tasso di rimozione delle eteroproteine ​​può raggiungere il 99%. Tra questi, la tecnologia di filtrazione a membrana a fibra cava ha i vantaggi della forza di taglio lieve e bassa, non facile da collegare, funzionamento flessibile, lunga durata, basso costo e amplificazione facile, quindi si consiglia di scegliere fibra cava per VLP concentrata e purificata.

 

Quando viene utilizzato il metodo ultrafiltrazione per la concentrazione e la purificazione, è molto importante selezionare la giusta dimensione dei pori della membrana, che determina direttamente l'efficienza e la qualità della concentrazione. Da un lato, è necessario selezionare l'apertura della membrana per intrappolare efficacemente le molecole target per garantire la resa e, dall'altra parte, l'effetto di rimozione e la velocità di elaborazione delle eteroproteine ​​devono essere considerati pienamente. Pertanto, il principio migliore è selezionare la membrana con la dimensione dei pori più grandi che può intrappolare la molecola target e provare a selezionare la membrana del filtro con distribuzione uniforme delle dimensioni dei pori.

 

Purificazione primaria:

1. Metodo di precipitazione

PRUCIVIZIONE Glicole polietilenico (PEG): la precipitazione selettiva dei VLP richiede una concentrazione ottimizzata di PEG e concentrazione di sale per bilanciare la resa e la purezza.

 

2. Cromatografia

Cromatografia di affinità:

Affinità eparina: usando le proprietà VLP della carica negativa di superficie (ad es. HPV VLP).

Cromatografia di accoppiamento anticorpo: alta specificità ma costosa.

Cromatografia a scambio ionico (IEX): scegliere Exchange anionico (EG, colonna Q) o scambio di cationi (EG, colonna SP) a seconda delle caratteristiche della carica superficiale VLP e ottimizzare il gradiente di pH e sale per evitare l'aggregazione delle particelle.

Cromatografia di interazione idrofobica (HIC): basato sull'idrofobicità della superficie VLPS, adatta per alcuni VLP non incapsulati.

 

Purificazione fine:

Cromatografia di esclusione molecolare (SEC, filtrazione in gel):

Rimozione di proteine ​​ospiti residue, acidi nucleici o aggregati, accompagnati dalla sostituzione del tampone. Flusso elevato ma basso flusso, spesso usato come fase di raffinamento finale.

 

Cromatografia multi-modalità:

Ad esempio, le resine della serie core Capto, combinate con lo scambio di ioni e l'effetto setaccio molecolare, possono rimuovere una varietà di impurità in un unico passaggio.

 

Inattivazione del virus/rimozione dell'acido nucleico (se necessario):

Trattamenti di nucleasi: come la benzonasi degradano il DNA/RNA dell'ospite.

UF/DF: coordinamento del sistema TFF per rimuovere piccoli frammenti di acidi nucleici ed enzimi.

 

Concentrazione e preparazione:

Filtrazione a flusso tangenziale (TFF):

Concentrati ai titoli di destinazione mentre si spostano i tamponi (come PBS o tamponi di formulazione).

 

Filtrazione sterile:

0. La filtrazione della membrana 22μm garantisce la sterilità.

 

Caso tipico

Di seguito sono riportati i processi di purificazione a valle per i tipici vaccini VLP.

 

 

A proposito di Guidling

La tecnologia di guida è un'impresa orientata alla produzione e ad alta tecnologia incentrata sul chiarimento, la separazione e la purificazione a valle dei biofarmaci. I prodotti sono ampiamente utilizzati nel processo di filtrazione di mAb, vaccino, diagnosi, prodotti ematici, siero, endotossina e altri prodotti biologici; La tecnologia di guida ha "Filtro delle cassette e dispositivo di filtrazione a flusso tangenziale", "membrana in fibra cavata", "filtro virus", "membrana profonda", "filtro di sterilizzazione", "dispositivi di filtro centrifugo" e altri prodotti e ha un gran numero di linee di prodotti, da piccole linee di prodotti dispositivo di filtrazione di produzione, soddisfare le esigenze di test e produzione. La tecnologia di guida non vede l'ora di collaborare con te!