Tecnologia di inattivazione e rimozione del virus degli emoderivati
I prodotti sanguigni sono "componenti delle proteine del plasma o componenti delle cellule del sangue, come albumina del sangue umano, immunoglobulina umana, concentrato di globuli rossi del fattore della coagulazione umano (naturale o ricombinante), ecc., separati dal plasma umano sano o dal plasma umano specificamente immune, purificato o realizzati mediante la tecnologia del DNA ricombinante, a fini diagnostici, terapeutici o di immunoprofilassi passiva”. I prodotti sanguigni svolgono un ruolo importante nelle emergenze mediche, nel salvataggio dei feriti di guerra e nella prevenzione e nel trattamento di alcune malattie specifiche.
Contesto normativo
Le pratiche di garanzia della sicurezza devono garantire che il farmaco finale sia sicuro per gli enti regolatori e, in ultima analisi, per i pazienti e il pubblico. Negli anni '90, la Conferenza di coordinamento internazionale (ICH 1998) ha pubblicato il documento "Q5A: Viral Safety Assessment of Biotechnological Products of Human or Animal Origin Cell Lines" (Q5A: Viral Safety Assessment), stabilendo uno standard mondiale per la sicurezza virale.
ICH Q5A descrive uno schema a più livelli per testare e convalidare per raggiungere questo obiettivo. Il programma di test si concentra sulla raccolta di banche cellulari, materie prime e bioreattori, integrato dall'analisi dei rischi del prodotto. Oltre ai test, l'ICH Q5A richiede che la decontaminazione a valle venga valutata come misura di sicurezza quando non vengono rilevati contaminanti a monte. La verifica dell'autorizzazione garantisce che, se un virus elude il regime di test, può essere rimosso e/o inattivato prima di finire nel prodotto farmaceutico finale.
Contesto del programma generale di protezione antivirus
Nella moderna produzione biotecnologica (o biotrattamento), di solito ci sono tre o quattro operazioni unitarie nell'intera sequenza purificata, in grado di rimuovere o inattivare il virus. Ciò include alcune fasi cromatografiche (come la proteina A o lo scambio anionico), coltura di pH basso o detergenti e filtri di ritenzione del virus. Non tutti questi passaggi rimuoveranno o disattiveranno efficacemente tutti i virus.
Ad esempio, la coltura a basso pH è solitamente inefficace per l’inattivazione dei virus senza involucro, ma funziona bene per l’inattivazione dei virus con involucro. In determinate condizioni operative, la colonna a scambio anionico potrebbe non essere in grado di legare e rimuovere i virus isoelettrici neutri dal flusso di prodotto, ma è efficace contro i virus acidi.
Si tratta di una combinazione di tre o quattro unità operative indipendenti e ortogonali che insieme garantiscono la sicurezza virale dei prodotti biotecnologici.
In genere si presuppone che una fase di elaborazione robusta, efficiente e affidabile sia in grado di rimuovere o inattivare un gran numero di virus (tipicamente definito come 4 log10 o superiore, dove il valore di riduzione logaritmica o LRV viene calcolato come log10 del totale numero di virus nell'input diviso per il numero totale di virus nell'output). Tuttavia, l’LRV non può essere utilizzato come un’unica misura assoluta dell’efficacia di un passo. I dati potrebbero essere preliminari. È facile da modellare, relativamente insensibile ai cambiamenti nelle condizioni del processo ed efficace contro una vasta gamma di virus (OMS 2004).
La filtrazione virale è ampiamente riconosciuta come una fase del processo potente ed efficace ed è una componente chiave della strategia complessiva per ridurre al minimo il rischio di particelle virali esogene ed endogene durante la produzione di prodotti biotecnologici.
I filtri virali spesso funzionano attraverso meccanismi di ritenzione forti e basati sulle dimensioni. Sulla base di questo potente meccanismo d’azione, i filtri virali hanno maggiori probabilità rispetto ai passaggi cromatografici di fornire una ritenzione virale prevedibile per una serie di virus. Questo perché è meno probabile che il filtro venga influenzato dalle differenze nelle proprietà fisico-chimiche dei diversi virus e dalle interazioni virus-resina regolate dalle condizioni operative. Pertanto, la fase di filtrazione virale è comunemente utilizzata nei processi di purificazione delle proteine terapeutiche ricombinanti ben progettati (EMEA 1996), che hanno dimostrato di avere solide prestazioni anche nel settore della lavorazione del plasma.
Tuttavia, i prodotti sanguigni sono come un’arma a doppio taglio, che non solo salva migliaia di vite, ma può anche diffondere malattie e rappresentare una minaccia per la salute umana. Secondo le statistiche, dal 1977 al 1984, almeno 30,000 riceventi di sangue negli Stati Uniti hanno ricevuto sangue infetto dal virus dell'AIDS. Nel 1985, 1.200 emofiliaci su 3,000 in Francia furono infettati dall'AIDS attraverso trasfusioni di sangue o prodotti sanguigni.
Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità, dal 5% al 10% delle infezioni da AIDS nel mondo sono causate da trasfusioni di sangue o di prodotti sanguigni infetti da AIDS. Il primo caso di AIDS in Cina è stato infettato utilizzando prodotti sanguigni importati infetti dal virus dell’AIDS. È stata inoltre segnalata la trasmissione di malattie dell'epatite B e C dovuta a trasfusioni di sangue ed emoderivati.
1. Principali virus trasmessi dagli emoderivati e loro caratteristiche
Esistono molti tipi di virus che vengono trasmessi attraverso il sangue e gli emoderivati, come mostrato nella Tabella 1. Tra questi, HIV, HBV e HCV sono stati preoccupati dagli ambienti medici nazionali ed esteri a causa del loro alto tasso di infezione e dei gravi danni.
Poiché il sangue e i suoi prodotti sanguigni possono diffondere virus, ciò ha seriamente compromesso la sua applicazione nella prevenzione e nel trattamento delle malattie. Pertanto, nella produzione di prodotti sanguigni, è necessario aggiungere processi di inattivazione e rimozione del virus per garantire la sicurezza dei prodotti sanguigni.
2. Principali metodi di inattivazione e rimozione del virus
Al fine di garantire la sicurezza dei prodotti sanguigni, oltre alla selezione dei donatori di sangue, all'immunizzazione ove possibile e ai severi test del sangue raccolto e ad altre misure, l'inattivazione e la rimozione del trattamento virale dei prodotti sanguigni rappresenta un collegamento importante per garantire la sicurezza dei prodotti sanguigni. sicurezza della trasfusione di sangue. Di seguito vengono descritti in dettaglio diversi metodi comunemente utilizzati ed efficaci per inattivare e rimuovere i virus.
I. Metodi di inattivazione dei virus
1. Metodo Pasteur
La base teorica di questo metodo è che il tasso di distruzione della struttura del virus è molto più elevato di quello della struttura delle proteine attraverso la selezione della temperatura e del tempo di azione. Quasi 50 anni di risultati di utilizzo clinico e recenti esperimenti su animali hanno confermato che l'albumina in soluzione dopo un trattamento termico a 60 gradi e 10 ore, ovvero la disinfezione Pasteur, può non solo inattivare l'HBV, ma anche inattivare l'HCV e l'HIV, rendendo l'albumina la soluzione più affidabile prodotto sanguigno nella sicurezza virale.
Recentemente, il processo Pasteur è stato esteso alla produzione di IVIG, FVI, FIX, fibrinogeno e altri prodotti. Bridonnccu et al. ha aggiunto questo processo di inattivazione del virus al processo IVIG di produzione di etanolo a bassa temperatura, ovvero il metodo Pasteur è stato implementato in condizioni di assenza di stabilizzante, basso contenuto di sale e acidità e il titolo del virus è diminuito di 5 log. Simmonds et al. hanno testato il virus trasmesso per trasfusione (TTV) di preparati concentrati FVⅢ e FIX utilizzati clinicamente nel Regno Unito e hanno scoperto che il tasso di rilevamento del TTV dei prodotti senza inattivazione del virus Pasteur era compreso tra il 50% e il 75% e il tasso di rilevamento positivo dei prodotti dopo l'inattivazione di Pasteur era 0.
Il tasso di positività al TTV è stato del 27% in 84 pazienti emofilici nel Regno Unito che hanno utilizzato prodotti a base di fattori della coagulazione non inattivati, mentre solo 1 su 19 pazienti che hanno utilizzato prodotti a base di fattori della coagulazione inattivati dal virus è risultato positivo, con un tasso di rilevamento positivo del 5%. Pertanto, il processo di inattivazione del virus è molto efficace nel migliorare la sicurezza dei prodotti sanguigni.
2. Solvente organico combinato con tensioattivo (metodo S/D)
This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Un gran numero di prodotti sanguigni inattivati con il metodo S/D si sono dimostrati sicuri e affidabili attraverso l'applicazione clinica a lungo termine, quindi sono ampiamente utilizzati. Tuttavia, questo metodo non ha capacità di inattivazione contro il parvovirus B19, HEV e altri virus non rivestiti con lipo.
3. Metodo di inattivazione del calore secco
L'inattivazione con calore secco significa che la preparazione liofilizzata viene trattata mediante riscaldamento e il virus viene ucciso dal calore secco. I metodi di calore secco comunemente utilizzati sono il metodo di riscaldamento a 60 gradi ~80 gradi, 10~72 ore e il metodo di trattamento a 80 gradi, 72 ore. Già all'inizio degli anni '80, era utile riscaldare la preparazione concentrata liofilizzata di FVIII e il complesso protrombinico a 60 gradi ~ 80 gradi per 10 ~ 72 ore. Tuttavia, è stato dimostrato che questo metodo non può inattivare completamente HBV, HCV, HIV. È stato dimostrato che il trattamento con calore secco a 80 gradi e 72 ore è efficace nell’inattivare HBV, HCV e HIV. Sono stati inoltre segnalati recentemente preparati liofilizzati di fattori della coagulazione trattati a 100 gradi. Xu Jinbo et al. hanno trattato le IgG a 100 gradi per 30 minuti e hanno inattivato il virus della stomatite vescicolare 8.2 Log. Alcune persone congelano il FVIII essiccato a 68 gradi per 72 ore, allo stato secco e poi lo riscaldano a 100 gradi per 0,5~1 ora. Questo metodo è relativamente economico.
4. Metodo fotochimico
This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Registro delle cellule legate all'HIV e le piastrine sono rimaste in buone condizioni dopo 7 giorni di conservazione funzionale in vitro, che è stata approvata dalla FDA per gli studi clinici.
Tra questi metodi, il metodo di disinfezione Pasteur e il metodo S/D sono approvati dalla FDA degli Stati Uniti e sono ampiamente utilizzati nel mondo. Il metodo di inattivazione con calore secco è adatto principalmente per l'inattivazione virale di preparati liofilizzati. Il metodo fotochimico ha un forte effetto di inattivazione sui virus rivestiti di lipidi ed è stato utilizzato nell'inattivazione dei virus del plasma intero in Europa e ha ampie prospettive per l'inattivazione dei virus nei componenti delle cellule del sangue. Tuttavia, tutti questi metodi hanno i loro limiti, ad esempio la sterilizzazione Pasteur non è ideale per l'inattivazione di alcuni virus resistenti al calore; Il metodo S/D non è riuscito a inattivare efficacemente il virus non rivestito di lipo. Il metodo fotochimico ha danneggiato significativamente l’attività di alcune proteine plasmatiche. L’attuale utilizzo clinico delle indagini di follow-up dimostra che nessun metodo di inattivazione del virus può garantire che i prodotti sanguigni siano assolutamente esenti dal rischio di trasmissione di virus.
I. Processo di rimozione del virus
Nella produzione di prodotti sanguigni, un processo di inattivazione non può inattivare tutti i virus; Inoltre, il virus stesso è una proteina eterologa, pertanto l'input con il prodotto produrrà reazioni avverse; Allo stesso tempo, a causa delle limitazioni del livello tecnico, ci sono ancora virus le cui caratteristiche non sono state trovate o comprese, quindi i metodi di inattivazione dei virus esistenti non possono garantire l'effetto di inattivazione di questi virus. Pertanto, l'inattivazione da sola non può garantire la sicurezza del prodotto e deve essere rimossa dal prodotto. Pertanto la tecnologia di rimozione dei virus sta ricevendo sempre più attenzione. Di seguito vengono brevemente descritti due processi di rimozione dei virus comunemente utilizzati ed efficaci.
1. Tecnologia cromatografica
La tecnologia cromatografica si riferisce all'uso di vari componenti e di differenze di affinità o interazione di fase stazionaria, per ottenere la separazione di vari componenti. Essendo una tecnologia avanzata per la produzione di prodotti sanguigni, la cromatografia stessa ha l'effetto di rimuovere i virus, in particolare la cromatografia di affinità e la cromatografia a scambio ionico. Per la cromatografia a scambio ionico, l’eluizione presenta vantaggi rispetto alla penetrazione nella rimozione del virus. La tabella 2 mostra i dati statistici del tasso di rimozione dell'HAV mediante tecnologia cromatografica nel processo di produzione dell'albumina da parte della società CSL in Australia. Come si può vedere dalla Tabella 2, la cromatografia a scambio ionico e la filtrazione su gel sono più efficaci nella rimozione dell'HAV, con una velocità di rimozione totale di 10,9 Log.
Nella produzione del FVIII, Baxter Healtheare esegue la cromatografia di immunoaffinità utilizzando gel trattati con anticorpi anti-FVIII, che possono rimuovere (4.2±0.1)Log e (5.3±0.9)Log da non -virus rivestiti di lipidi come PPV e HAV, rispettivamente.
2. Filtrazione su nanofilm
Per alcuni virus con diametro superficiale ridotto, come HAV e parvovirus B19, la filtrazione su nanomembrana è il metodo di rimozione più efficace. Sfrutta la differenza dimensionale tra proteine e virus e l'assorbimento dei virus da parte della membrana filtrante per isolare i virus. È stato condotto uno studio di laboratorio presso il sito di fornitura di sangue Sanquin nei Paesi Bassi sulla rimozione dei virus aggiungendo una filtrazione con nanomembrana Planova 15N in due fasi e in un solo passaggio al processo di produzione del complesso protrombinico. Si è riscontrato che i tassi di rimozione di HIV, HAV e altri virus aumentavano a vari livelli dopo la filtrazione su nanomembrana (vedere Tabella 3).
Tuttavia, quando questo metodo viene applicato alla produzione industriale possono verificarsi i seguenti problemi: in primo luogo, a causa dell'elevata viscosità del prodotto e della presenza di proteine di grande diametro, la dimensione dei pori della membrana selezionata dal filtro non dovrebbe essere troppo piccola, limitando così la rimozione di virus di piccolo diametro come l'HCV; In secondo luogo, la stabilità del controllo della dimensione dei pori della membrana nel processo di produzione del filtro influenzerà la rimozione del virus. In terzo luogo, quando l'apertura della membrana inferiore al diametro della particella virale viene bloccata, la portata del prodotto verrà ridotta, influenzando la resa. Pertanto, la selezione di membrane le cui proprietà e dimensioni dei pori sono adatte alle esigenze dei prodotti trasformati è un fattore importante per verificare se la filtrazione con nanomembrana può rimuovere i virus.
3. Discussione
Con la premessa di garantire la qualità della fonte di sangue, il processo di inattivazione e rimozione del virus è un mezzo importante e necessario per garantire la sicurezza dei prodotti sanguigni. L'uso di un solo processo virale inattivato non può assolutamente garantire la sicurezza dei prodotti sanguigni. Sulla base della tecnologia di inattivazione del virus, è stata aggiunta la tecnologia di rimozione del virus come la cromatografia e la filtrazione con nanofilm, la velocità di rimozione del virus è stata notevolmente aumentata e l'effetto di inattivazione e rimozione del virus è stato significativamente migliorato. Allo stato attuale, l'Europa ha chiaramente proposto che nel processo di produzione dei prodotti sanguigni si debba utilizzare almeno un'inattivazione e la rimozione dei virus per garantire la sicurezza dei prodotti sanguigni.
In Cina, la maggior parte dei produttori di prodotti sanguigni utilizza solo un processo con virus inattivato nel processo di produzione, come il metodo di disinfezione Pasteur, il metodo S/D, ecc., ma non utilizza il processo di rimozione del virus, che influisce gravemente sulla qualità dei prodotti sanguigni. Con l'adesione della Cina all'OMC, il processo di produzione e gli standard di qualità dei prodotti sanguigni nazionali saranno in linea con quelli del mondo, altrimenti non potrà garantire la quota di mercato interno esistente, ma non potrà nemmeno competere con prodotti simili in altri paesi del mercato internazionale.
Pertanto, i produttori cinesi di prodotti sanguigni devono migliorare il processo di produzione, rafforzare l'inattivazione e la rimozione del virus, in modo da garantire pienamente la qualità e la sicurezza del prodotto. Pertanto, i produttori cinesi di prodotti sanguigni tenderanno a utilizzare la cromatografia per purificare i prodotti sanguigni e rimuovere i virus per garantire la sicurezza dei prodotti sanguigni.
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