Come scegliere il tubo di ultrafiltrazione appropriato
I tubi di ultrafiltrazione comunemente usati per la concentrazione proteica e la sostituzione del tampone sono spesso utilizzati nei tubi di ultrafiltrazione. Esistono altri modelli, che hanno diverse dimensioni di volume e tubi di ultrafiltrazione, a seconda del peso molecolare della proteina bersaglio, del volume prima della concentrazione e del volume target di concentrazione. Riutilizzabile.
1. Selezionare un tubo di ultrafiltrazione adatto, considerando principalmente MWCO e volume di concentrazione. Generalmente, il peso molecolare non deve essere superiore a 1/3 del peso molecolare della proteina bersaglio. Se il peso molecolare della proteina bersaglio è di circa 10 kd, è possibile utilizzare un tubo di ultrafiltrazione con un peso molecolare trattenuto di 3 KD.
2. L'ultrafiltrazione appena acquistata è asciutta. Aggiungere acqua milliq prima dell'uso. L'acqua passa completamente attraverso la membrana e viene preraffreddata in un bagno di ghiaccio o in frigorifero per alcuni minuti. Quindi versare l'acqua per aggiungere la soluzione proteica. La quantità di soluzione proteica non deve superare la linea bianca sulla parte superiore della provetta. Funzionamento facile. Prima di aggiungere la soluzione proteica, il tubo di ultrafiltrazione deve essere inserito nel ghiaccio per il pre-raffreddamento.
3. Equilibrio. La massa e il centro di gravità devono essere bilanciati. Si noti che la velocità e l'accelerazione non dovrebbero essere troppo veloci, altrimenti la membrana di ultrafiltrazione sarà direttamente danneggiata. Avviare l'ultrafiltrazione centrifuga (preraffreddamento della centrifuga a 4 gradi). La direzione del diaframma e dell'albero rotante può essere regolata secondo le istruzioni (nel caso della centrifuga angolare, il diaframma è perpendicolare all'albero). Nell'uso effettivo, la velocità generale è inferiore a quella specificata nel manuale, il che può prolungare la durata del tubo centrifugo.
4. quando concentrato al restante 1 ml, [prendere la soluzione di Bradford domestica da 50ul, aggiungere liquido da 10ul per vedere se diventa blu e determinare se il tubo di ultrafiltrazione perde la proteina. Se il tubo perde, versarlo nello strato superiore e quindi tornare al nuovo tubo per avviare l'ultrafiltrazione. Per determinare con precisione se la provetta perde, si prega di centrifugare 5mg 10min 10min, quindi passarlo attraverso, eseguire il gel proteico o Bradford] [misurazione grossolana]. Continuare ad aggiungere la soluzione proteica rimanente da concentrare (operare sul ghiaccio per evitare il riscaldamento delle proteine) fino a quando non vengono aggiunte tutte le soluzioni concentrate. Durante la centrifugazione, prestare attenzione a se si verifica la precipitazione delle proteine e causa il blocco del tubo. Se si verifica una precipitazione, determinare la causa specifica della precipitazione, se la concentrazione proteica è troppo alta o se il tampone è inappropriato; Il primo può essere risolto utilizzando più tubi di ultrafiltrazione contemporaneamente per ridurre la concentrazione, mentre il secondo può cambiare diversi tamponi fino a quando la proteina precipita.
5. I passaggi precedenti vengono utilizzati per concentrare le proteine. Se il tampone deve essere sostituito, quando la soluzione proteica totale è concentrata a circa 1 ml, aggiungere delicatamente un nuovo tampone (ultrafiltrazione attraverso membrana di ultrafiltrazione da 0,22um), quindi concentrarsi continuamente a circa 1 ml per tre volte, in modo che la concentrazione finale dipenda dalla concentrazione proteica richiesta, che di solito non è superiore a 500 ul o inferiore a 200 us. Secondo la concentrazione di volume di almeno 10 volte ogni volta, è più di 1000 volte quella di tre volte, il che può fondamentalmente raggiungere lo scopo di cambiare il buffer.
6. Rimuovere il concentrato proteico finale. Operare sul ghiaccio. Utilizzando una punta di pipetta gialla (200ul), inserire delicatamente la punta della pipetta lungo il bordo, quindi soffiare delicatamente e mescolare la soluzione proteica. Fare attenzione a non toccare la membrana di ultrafiltrazione. Aspirare la soluzione concentrata a 200ul ogni volta fino a quando non viene completamente aspirata. Non è necessario estrarre l'ultima soluzione concentrata sul fondo della provetta, altrimenti è troppo difficile e la membrana di ultrafiltrazione potrebbe essere danneggiata. Infine, l'acqua milliq viene aggiunta al tubo di ultrafiltrazione senza passare attraverso la membrana di ultrafiltrazione per evitare la perdita d'acqua e l'essiccazione della membrana.
7. Di seguito sono riportati i passaggi per il trattamento del tubo di ultrafiltrazione e il riutilizzo del tubo di ultrafiltrazione.
8. Versare acqua nel tubo di ultrafiltrazione e risciacquare delicatamente con acqua milliq per più volte. [se c'è un'evidente precipitazione proteica sul fondo della provetta, è possibile aggiungere prima acqua e poi soffiarla via con una pipetta. Fare attenzione a non toccare la membrana. Il sedimento pende e poi scappa. Non puoi sciacquarlo con l'acqua del rubinetto. Dopo aver aggiunto la soluzione di NaOH da 0,2 m, posizionarla a temperatura ambiente per 20 minuti e bilanciare il tubo di ultrafiltrazione durante questo periodo. Centrifugare per altri 10 minuti. Versare la soluzione naOH rimanente e immergere il nucleo di cotone nel becher (1 o 2L) Milliq acqua, posto per diverse ore, e quindi sostituito con acqua nuova, posto per diverse ore per diluire continuamente la concentrazione di NaOH. Lavare la provetta da 50 ml e coprire con acqua di rubinetto e lavare la parete interna con acqua milliq.
9. Estrarre il nucleo della provetta immerso, aggiungerlo all'acqua piena di milliq e quindi riempire la provetta da 50 ml con acqua milliq. Mettere lentamente il nucleo del tubo in 50 ml.
Centrifugare il tubo, scolare e dividere l'acqua, quindi coprire e conservare a 4 gradi fino al prossimo utilizzo. In generale, secondo i passaggi e le precauzioni di cui sopra, ogni tubo non si romperà entro tre o quattro anni.